亚抑菌浓度氟苯尼考作用下质粒pSD11对大肠杆菌适应性的影响

通过分析cfr阳性质粒pSD11对大肠杆菌的适应性影响,并测定氟苯尼考对携带质粒pSD11的大肠杆菌MG1655(Escherichia col MG1655)的最低筛选浓度(MSC),评价亚抑菌浓度氟苯尼考作用下多重耐药基因cfr在大肠杆菌中的持续存在和扩散传播的风险.通过电转化的方法将质粒pSD11导入模式菌E.coli MG1655中,获得耐药菌株E.coli MG1655/pSD11.通过测定生长曲线,比较无抗生素作用下耐药菌株E.coli MG1655/pSD11与同源敏感菌株E.coli MG1655的生长动力学参数,评价质粒pSD11对宿主菌适应性的影响.并通过比较分析不同亚抑菌浓度(0.031 25,0.062 5,0.125,0.25,0.5,1.0和2.0μg/mL)氟苯尼考作用下的生长速率,测定氟苯尼考对携带质粒pSD11的宿主菌最小筛选浓度(MSC).携带质粒pSD11的耐药菌E.coli MG1655/pSD11的延滞时间(2.853 3±0.031 8 h/λ)相对于同源敏感菌E.coli MG1655极显著延长(2.825 3±0.024 4 h/λ),且世代时间也显著延长(分别为:1.705 7±0.006 4 h/G和1.526 9±0.007 8 h/G).氟苯尼考对耐药菌E.coli MG1655/pSD11的MSC为0.042 5μg/mL约为相应敏感菌的MICsus的1/100.本研究表明携带cfr基因的质粒pSD11在无抗生素选择下对宿主菌有明显的适应性影响,但是在极低的氟苯尼考浓度的作用下存在选择优势,能够平衡适应性成本使宿主菌得到富集与传播,以期为对该质粒在环境中的传播风险评估及氟苯尼考的临床应用提供的参考.(图2表2参18)     

中药三黄汤、小檗碱对E.coli生长抑制作用与庆大霉素的比较

庆大霉素对E．coli的抑菌作用强，试管稀释法、琼脂稀释法和平板抑菌圈法抑菌试验得到一致的MIC(3-5μg／mL)；三黄汤、小檗碱抑菌作用弱而稳定，试管稀释法测得的MIC分别为500mg／mL和2．5mg/mL，而用平板抑菌圈法得不到明显的抑菌圈．在亚MIC药物液体分批培养时，庆大霉素抑菌曲线起初2h迅速下降，而后回升到初始浓度，而三黄汤抑菌曲线平缓稳定，说明中药和抗生素的抑菌机制明显不同．庆大霉素与小檗碱混合使用时，与庆大霉素单独使用相近，而与三黄混合使用时，则主要表现三黄汤的抑菌作用．因此中西药结合时需要慎用．在接近MIC药物培养基中连续传代20次后，庆大霉素MIC提高8倍多，而三黄汤和小檗碱MIC无显著变化，无抗药性产生，也不产生对庆大霉素的交叉抗药性．研究结果还表明，在1／4MIC三黄汤中连续传代20次，能消除E.coli已形成的庆大霉素抗性，这为解决抗生素抗药性提供了线索．图4参23     

红谷霉素对细菌耐药性质粒转移的抑制作用

以Shigella flexneri D15 R-plasmid CmR和Escherichia coil 1485 RifR为试验菌株,研究红谷霉素对细菌耐药性质粒在细菌之间转移的抑制作用及对两种细菌R质粒的消除作用.将红谷霉素(30μg/mL)与S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coli 1485 RifR按实验设计混合并分别培养24 h和48 h,涂布在麦康凯琼脂平板上,计算相应菌落数.结果表明,当红谷霉素抑菌浓度为30μg/mL时,对细菌耐氯霉素的R质粒的转移抑制率分别达到92.82%(24 h培养)和96.04%(48 h培养),但对R质粒的消除作用不显著.说明红谷霉素对R质粒转移抑制作用强烈但不具有R质粒的消除作用.     

抗生素与中药对大肠杆菌的联合抑菌作用及机理

为研究抗生素和中药对环境及生物体中菌群的联合毒性作用,以2种常用抗生素氨苄西林钠(ampicillin sodium,AMP)、盐酸四环素(tetracycline hydrochloride,TET)和1种中药提取物盐酸小檗碱(berberine chloride hydrate,BCH)为目标污染物,以大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)为指示生物,分别应用直接均分射线法和均匀设计射线法设计3个二元(AMP-BCH、AMP-TET、BCH-TET)及1个三元混合物体系(AMP-TET-BCH),共20条射线,采用以96孔微板为实验载体的时间微板毒性分析法(time-dependent microplate toxicity analysis method,t-MTA)对3种药物及其混合物体系的毒性进行系统测定.运用拟合归零法分析混合物毒性相互作用类型及强度,选取抑菌作用明显的代表性混合物射线进行暴露前后E. coli核酸溶出量以及电镜扫描分析.结果表明,AMP、TET、BCH及其混合物体系对E. coli的浓度效应曲线为“S”型且时间和浓度依赖抑菌性明显,仅...     

离子液体[BMIm][PF6]增强抗性质粒RP4介导的接合转移基因mRNA的表达水平

环境中广泛存在的抗生素和抗生素抗性基因会导致很严重的人类健康风险。在我们前期研究中发现,离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])作为环境选择性压力可以促进抗生素抗性基因的水平转移。本研究以E.coli DH5α(RP4)和同属的E.coli HB101,以及E.coli DH5α(RP4)和跨属的Salmonella enterica之间的纯菌接合转移体系为考察对象,从mRNA基因表达调控水平角度阐明离子液体[BMIm][PF6](0.001~2.5 g·L-1)影响质粒RP4接合转移的机理。结果表明,离子液体[BMIm][PF6]通过抑制基因kor A,kor B和trb A的mRNA表达水平来提高接合和跨膜转运基因trb Bp和trf Ap的表达;增强水平转移基因tra F的mRNA表达水平,并通过增强负调控基因kil A和kil B的mRNA表达水平抑制质粒的垂直传递过程;通过抑制基因trb K的mRNA表达水平降低接合转移体系的排斥效果,从而促进质粒RP4的接合转移。该结果有助于为抗生素抗性基因在环境中水平转移扩散的机理研究提供理论依据。     

parDE基因对重组质粒pLM2在Enterobacter gergoviae 57-7中稳定性的影响

将 parDE基因克隆到载有组成型表达nifA基因的质粒 pST10 2 1上 ,得到重组质粒pLM2 .将 pLM2 ,pST10 2 1分别转到玉米联合固氮菌Enteorbactergergoviae 5 7 7(E5 7 7) ,获得转化子E5 7 7(pLM2 ) ,E5 7 7(pST10 2 1) ,二者在c(NH+ 4 ) =5 0mmolL-1的Kp培养基中表达的固氮活性一致 .将pLM2 ,pST10 2 1分别转到E .coliDH5α(pMGFP2 .1) ,培养物用 4 88nm光激发后在 5 10nm均有相同的的荧光特征发射峰 .上述实验表明 ,重组质粒pLM2仍保留了原质粒pST10 2 1中nifA的功能 .但质粒 pLM2和 pST10 2 1在E5 7 7中的稳定性试验表明 ,E5 7 7(pST10 2 1)在无抗生素的LB中继代培养 70代后 ,质粒几乎全部丢失 (仅存 1% ) ;而E5 7 7(pLM2 )继代培养 10 0代后 ,质粒全部存在 (10 0 % ) .图 4表 1参 12     

柠檬醛体外抗MRSA活性及其对β-内酰胺类抗生素的增效作用

通过体外抑菌实验评价柠檬醛单独使用以及与3种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄及头孢吡肟)联合使用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的抑制效果.采用微量稀释法测定柠檬醛与3种β-内酰胺类抗生素的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)及最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC);用微量棋盘法测定柠檬醛与3种β-内酰胺类抗生素的分级抑菌浓度(Fractional inhibitory concentration,FIC)指数;用分光光度法测定柠檬醛和阿莫西林联合使用后对MRSA生长的抑制效果.结果显示:柠檬醛MIC和MBC分别为695-2 780μg/mL和1 390-2 780μg/mL.联合药敏试验发现柠檬醛与3种β-内酰胺类抗生素联合使用FIC指数集中分布在≤0.5和0.5-1;与单独用药相比,阿莫西林、头孢氨苄和头孢吡肟的MIC_(50)分别降低为原来的1/9、1/15和1/9;1/4 MIC阿莫西林与1/4 MIC柠檬醛联合用药后,显著抑制了MRSA的生长.因此,柠檬醛具有一定的体外抗MRSA活性,与阿莫西林、头孢氨苄和头孢吡肟等β-内酰胺类抗生素联合使用时可增强β-内酰胺类抗生素的活性,降低其用量.     

刺红珠根中的生物碱

从利红珠根中分离到7个生物碱：8-氧小檗碱（1），巴马亭（2），小檗碱（3）．非洲防己碱（4），8-氧巴马亭（5），（±）-oblongine（6）和小檗胺（7）．通过波谱数据鉴定了它们的结构.首次用二维核磁对8-氧小檗碱和小檗胺的氢谱与碳谱进行了指定．     

抗生素单一及联合暴露对RP4质粒介导的抗性基因水平转移的hormesis效应研究

抗生素滥用导致的抗性基因(ARGs)泛滥问题引起人们的日益关注。目前关于抗性基因的研究主要集中在环境监测方面,但是关于抗生素对ARGs传播的影响研究还相对缺乏。质粒是ARGs传播的重要载体,因此以基于RP4质粒的大肠杆菌(E.coli)接合转移体系为研究对象,探讨了盐酸四环素、甲氧苄啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异唑在单一暴露条件下对RP4质粒接合转移的影响。根据单一暴露的结果设计混合抗生素的浓度比,探究抗生素联合暴露实验对质粒接合转移的影响。结果表明:在单一暴露条件下,只有盐酸四环素对含有四环素抗性的RP4质粒的接合转移频率有低促高抑的hormesis效应;在联合暴露条件下,对RP4质粒接合转移无促进作用的抗生素会抑制四环素的hormesis效应,这一定程度上降低了抗生素的环境风险。并且用受体理论解释了抗生素对质粒接合转移的hormesis效应产生机制,为目前尚无定论的hormesis受体理论机制提供了证据支持。     

营养物质对细菌质粒pEA9∷Km在土壤中接合转移频率的影响

用成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans) T7(pEA9∷Km)为供体菌,以E.a.339(pEA9-)为受体菌在天然土壤中进行接合实验,测定各种营养物质对重组质粒pEA9∷Km同源接合转移频率的影响.实验发现,如果在土壤中只加入生理盐水或无机盐培养基,就观察不到细菌数量的增加和质粒的转移;只有加入碳源物质后才检测到细菌数量的增加和质粒的接合转移,接合转移频率的大小位于1.2×10-4～4.4×10-4之间,与所加碳源物质的种类关系不大.图2 表1 参13     

快速评估近岸海洋水体与沉积物中E.coli与S.aureus抗生素抗性水平的新方法

随着抗生素抗性污染日益严重,快速评估环境中典型病原菌与条件性致病菌的抗生素抗性水平,对掌握区域环境抗生素抗性污染状况、揭示抗性污染传播规律至关重要。通过以最低抑菌浓度浸入抗生素改进MI、VJ培养基,并结合滤膜法,建立了针对近岸海洋环境中指示性病原微生物大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的抗生素抗性监测方法。水体和沉积物样品抗生素抗性水平评估实验结果显示,该方法具有较好重现性(水体和沉积物中E.coli和S.aureus抗生素抗性水平的相对标准偏差分别为11%、8%)与准确度(水体和沉积物中E.coli和S.aureus的平均回收率分别为83.5%、68.4%;相对于CLSI药敏试验的偏离度为±0.1)。且与CLSI药敏实验相比,该方法过程简便、耗时短(36 h/84 h),能最大限度节约经济和人员成本提高抗性评价效率。应用该方法评估辽河口与莱州湾环境中2种病原微生物磺胺类抗生素抗性水平,结果显示辽河口水体中E.coli和S.aureus磺胺二甲嘧啶的平均抗性率分别为27.0%、28.4%,沉积物中分别为35.5%、34.6%;莱州湾水体中E.coli和S.aureus磺胺二甲嘧啶的平均抗性率分别为26.0%、14.5%,沉积物中分别为12.0%、32.9%。该方法适用于河口、近岸海洋及入海排污口水体与沉积物样品中E.coli与S.aureus的快速分析及抗生素抗性水平评估。     

萘降解质粒pND6的分离和鉴定

从工业废水中分离的假单胞菌 (Pseudomonassp .)ND6菌株 ,能以萘为唯一碳源生长 ,使无机盐培养基(MM)中 2g/L的萘在 48h内降解 98% .该菌株含有一个 115kb的大质粒pND6 .DNA杂交实验表明 ,pND6质粒含有与恶臭假单胞菌 (P .putida)G7菌株的NAH7质粒同源的萘降解基因 .图 3表 1参 14     

链霉菌S227抗耐药性物质的分离及其活性研究

在抗耐药性活性筛选过程中,发现分离自四川峨嵋山森林土壤的一株链霉菌S227(Streptomyces sp.)的发酵液具有抗细菌抗生素耐药性生物活性.利用已建立的抗耐药性的活性检测方法(专利号:ZL01128969.4)[1]为跟踪手段,采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析以及薄层层析等方法,对该菌发酵液中抗耐药性活性物质进行分离纯化,得到了具有抗耐药性的活性单体S227-4,初步鉴定为四聚糖.利用MIC法对该样品的抗耐药活性进行研究:在证明该样品本身不具有抗菌活性的基础上,以临床分离的耐药菌株为指示菌,考察了该样品与抗生素联合使用时对耐药菌抗生素MIC(最小抑菌浓度)值的影响,结果表明,S227-4在不影响耐药菌生长的浓度下与不同的抗生素联合使用,可以明显提高不同耐药菌对不同抗生素的敏感性,如S227-4(200μg/mL)可以使S.aureus12334对红霉素的敏感性提高128倍.图2表2参8     

大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在氧化硫硫杆菌Tt-7中的表达

专性自养极端嗜酸性氧化硫硫杆菌缺乏EMP、ED途径以及三羧酸循环的关键酶 (如磷酸果糖激酶等 ) ,不能氧化有机物获得能量 .本文利用PCR技术扩增E .coliK 12磷酸果糖激酶 1基因 (pfkA) ,将该基因与广泛寄主的IncQ质粒pJRD2 15连接构建重组质粒pSDK 1,该质粒可与pfk基因缺陷株E .coliDF10 10互补 .通过接合转移的方式将其导入氧化硫硫杆菌Tt 7中并得到表达 .pSDK 1在宿主Tt 7中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下连续传 5 0代仍可保留 75 % .酶活性测定表明 ,pSDK 1的pfkA基因在缺陷株E .coliDF10 10中表达水平〔(96 .6± 0 .6 6 )U/g蛋白〕略高于原始菌株E .coliK 12〔(85 .9± 1.12 )U/g蛋白〕 ;而在氧化硫硫杆菌中则以较低水平进行表达〔(12 .4± 0 .73)U/g蛋白〕 ,并且其表达水平不受培养基中葡萄糖的影响 .实验表明 ,在无机盐培养基中加入葡萄糖时 ,含质粒pSDK 1的氧化硫硫杆菌Tt 7可利用培养基中的葡萄糖而加快生长 ,而对照菌株的生长则未受明显影响 ;但是重组菌利用葡萄糖的速度较缓慢 .图 5表 2参 16     

NiO/SrBi2O4可见光催化杀菌的研究

采用共沉淀法制备SrBi2O4,利用浸渍法将NiO负载到SrBi2O4表面上,制得可见光催化杀菌剂.紫外可见漫反射光谱的测定显示催化剂在400-650nm波长有吸收.表明NiO/SrBi2O4在可见光(λ＞420 nm)照射下对革蓝氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)有很高的杀菌活性.通过TEM观察和ICP测定反应过程中钾离子的浓度变化,证实细菌细胞壁和细胞膜均遭到破坏.     

苯甲酸类化合物的微生物降解研究

用富集培养法从工业污水中分离到5个能以苯甲酸为唯一碳源和能源而生长的细苗菌株：不动杆菌（Acinetobactersp.）BJ1，无色杆菌（Achromobactersp.）BY1，假单胞苗（Pseudomonasspp.）SJ1、SY1和SH1、测定了这5个菌株的底物特异性和抗菌素抗性其中BJ1菌株含有1个大质粒和2个小质位在最适培养条件下BJ1菌株对苯甲酸的降解率达98％以上．     

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.     

孔雀石绿降解菌M3的分离鉴定及降解特性研究

从鱼塘底泥中筛选分离出1株能高效降解低含量孔雀石绿(MG)的细菌M3.经16S rDNA同源性序列分析,鉴定为泛菌属(Pantoea sp.).30 ℃静止培养条件下,该菌株对0.5、1.0、2.0和5.0 mg·L-1孔雀石绿5 d的降解率分别为97.54%、97.1%、100%和77.8%.菌株M3不能以MG为唯一碳源进行生长和代谢.葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4/K2HPO4均能影响菌株M3对MG的降解.20～30 ℃温度范围内菌株M3对MG有明显降解效果,且降解速率随温度上升而提高.     

牛蛙生长激素基因在COS7细胞中的转染表达

应用RT-PCR技术克隆牛蛙生长激素(BfGH)的cDNA,T-A克隆法构建反向插入的pMD18-T/BfGH重组质粒,回收BamHⅠ酶切的BfGH cDNA片段,并与去磷酸化处理的真核表达载体VR1020/BamHⅠ,酶切鉴定方法筛选BfGH正向插入的重组真核表达质粒VBfGH.脂质体法介导质粒VBfGH转染哺乳动物细胞COS7,对转染后的COS7细胞进行RT-PCR、ELISA和免疫荧光检测,分别在转录和翻译水平证实BfGH基因在COS7细胞中得到了正确的转染表达.图4表1参17     

1株微小杆菌对4种蓝藻的生长影响

利用过滤的天然珍珠养殖水参照BG11配制加富培养液,将1株能促进鱼害微囊藻生长的微小杆菌属菌株(Exiguobacterium sp.013,简写为E.sp.013)进行纯化扩大培养后与铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、水华微囊藻(Microcystis flosaquae)、平裂藻(Merismopedia sp.)和惠氏微囊藻(Microcystis wesenbergii)按一定菌、藻密度比例同时接种后进行为期24 d的培养试验,利用特定生长率和细胞密度等指标观察并检验E.sp.013菌株对4种蓝藻生长的影响,同时检测培养液中优势菌群的数量变化趋势.结果表明:E.sp.013菌对铜绿微囊藻、水华微囊藻和惠氏微囊藻具有显著促生长和延长稳定生长期作用,对平裂藻不具有显著促生长作用,但对延长其稳定生长期具有显著效果;试验培养过程中E.sp.013菌落数量占所有菌落总数的比例始终高于46％,处于绝对优势地位,表明E.sp.013菌具有调控其他菌群的能力.