基于PCR-DGGE的重金属污染土壤微生物种群指纹分析

采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析方法,研究沈阳市细河沿岸重金属污染土壤中微生物结构多样性、种群丰富度及种群结构的动态变化规律。结果表明：直接从土壤中抽提总DNA,对16SrRNAV3可变区序列进行扩增,DGGE指纹图谱分析,微生物种群结构和变化规律明显,同时也表现为重金属污染程度越重,多样性指数越低;其中细河底泥重金属含量严重超标,多样性指数最低。经方差分析,重金属污染情况与Shannon-wiener多样性指数呈负相关,其中重金属污染对微生物的均匀度指数影响最显著,并且锌污染对其影响最大为-0.985。表明PCR-DGGE技术可以用于污染环境下微生物多样性研究,也为污染环境下土壤微生物多样性研究提供了新的实验方法与依据。     

重金属镉对水田土壤微生物基因多样性的影响

采用16S rDNA DGGE分析技术,探讨了不同处理时间、不同浓度镉胁迫条件下水田土壤微生物种群的基因多样性.研究发现,随着处理时间的不同,各处理间的土壤微生物基因多样性差异存在明显不同,培养初期镉对土壤微生物种群毒害作用非常明显,土壤微生物基因多样性下降,但培养后期不同处理之间DNA基因型差异很小,丰度差异较大.在土壤培养初期、含镉3～10 mg/kg的培养基上出现一条新增条带,为对照及低镉浓度土壤所没有,镉形态稳定后会消失,说明土壤中可能存在适官镉浓度下良好生长的微生物种,经序列测定及与网上比对分析.与一株Uncultured bacterium sp.具有96%的相似率,初步确定为一不可培养细菌种,以其作为淹水条件下镉污染初期的报告基因有一定的可行性.     

亚麻温水脱胶液中细菌菌群结构分析

为了探讨实验室条件下模拟的工厂亚麻温水脱胶液中细菌菌群结构,采用纯培养技术和PCR-DGGE技术(Denaturing gradient gel electrophoresis)对细菌菌群结构进行了研究.用纯培养方法分离获得9类菌落,其中假单胞菌属(Pseudomonas)在有氧培养条件下总是处于优势.梭菌属(Clostridium)在厌氧培养过程中总是处于优势.微球菌属(Micrococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)只有亚麻脱胶初期才有发现.PCR-DGGE指纹图谱显示,亚麻温水脱胶过程中条带数量较少且没有明显种群群落结构演替过程.通过对不同时期沤麻液中16S rDNAV3片段PCR产物d、e两个DGGE条带进行分子克隆、序列测定和Blas份析,发现e条带包含的16S rDNAV3片段除e 35外均属于假单胞菌属.d条带包含着较多不同的16S rDNAV3片段,其中有传统方法没有分离到的泛菌属(Pantoea)细菌、一些NCBI未收录的序列及一些非可培养微生物序列.纯培养技术和PCR-DGGE技术的共同使用,可以更全面准确地提供细菌多样性方面的信息.图4参15     

转cry1Ac+cry2Ab基因棉对土壤细菌群落结构和功能多样性的影响

以不同生育期转cry1 Ac+cry2Ab基因棉和常规棉田土壤为对象,采用传统平板培养、Biolog分析和变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究了该新型转基因材料对土壤细菌群落结构和功能多样性的影响。可培养细菌数量测定结果表明,在棉花整个生育期,2种棉田土壤可培养细菌数量具有相同的变化趋势;与常规棉相比,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉田可培养土壤细菌数量在蕾期存在显著差异(P0.05),其他生育期则无显著差异。Biolog分析结果显示,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉和常规棉田土壤细菌活性和碳源利用能力在苗期和蕾期存在明显差异,其他生育期则无明显不同。PCR-DGGE图谱的聚类分析结果表明,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉与常规棉田土壤细菌群落结构均随着生育期的不同而发生改变,且两者仅在花铃期出现明显差异。对PCR-DGGE条带的序列分析表明,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉与常规棉田土壤细菌之间的差异具有随机性,可能与采样时期或采样点的差异有关。综上所述,2种棉田土壤细菌群落结构和功能多样性在整个棉花生育期的变化趋势基本一致,转cry1Ac+cry2Ab基因棉仅在某些时期对其产生短暂影响,大部分时期无明显影响。     

人工接种堆肥和自然堆肥微生物区系与分子多态性的变化

采用传统培养方法和PCR-DGGE技术研究了人工接种堆肥和自然堆肥微生物群落的演变过程。结果表明:(1)传统培养方法显示,两种堆肥堆制过程中微生物数量均呈“升高—降低—升高—降低”变化趋势,整个堆肥过程中细菌数量占优势。(2)DGGE图谱显示,两种堆肥不同时期存在不同的细菌种群,其条带数量亦呈“升高—降低—升高—降低”变化趋势。堆肥升温期条带丰富但优势条带不明显;堆肥高温期条带数量减少但出现优势条带,表明高温阶段以嗜热菌或耐高温菌为主;堆肥降温期条带数量再次增多;堆肥腐熟期条带数量少且无优势条带,表明腐熟阶段微生物种群数量少且代谢强度趋于平缓。(3)DGGE图谱表明,人工接种菌株成为堆肥高温期优势菌株。人工接种增加了堆肥中微生物总量,提高了堆肥微生物种群多样性,并且促进了堆肥菌群演替,从而缩短堆肥腐熟时间。     

宿根甘蔗根际土壤细菌多样性分析中培养法与非培养法比较研究

采用培养法和非培养法提取甘蔗根际土壤微生物的总DNA,基于通用引物PCR扩增构建两种方法的细菌16SrDNA文库,并进行核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA),通过部分克隆序列测定构建细菌克隆文库的系统发育树,进而对基于传统的细菌平板培养法和直接提取总细菌DNA的非培养法进行比较分析.结果显示,非培养法文库的香侬–威纳指数、辛普森指数、丰富度分别为4.94、0.998、28.91,均高于培养法文库中相应的多样性参数(分别为4.27、0.996、16.79),均一度数值都>0.95.结合统计学数据和序列测定信息,反映出甘蔗根际土壤存在着丰富的细菌多样性,但平板培养法所展现的多样性低于直接提取法,表明前者存在着很大的局限性,而非培养法文库中主要是未培养微生物的16S rDNA序列,这从一个侧面反映了土壤样品中未培养微生物占很大比例.因此,在土壤微生物群落研究中,必须结合新的分子生态学技术手段,如采用直接提取总DNA的方法进行研究,才能比较全面地认识土壤微生物多样性.图3表3参18     

基于EEM与PCR-DGGE技术分析温度对蚯蚓堆肥处理城镇污泥的影响

将城镇脱水污泥制成5 mm粒径颗粒分别在15、20、25℃条件下进行蚯蚓堆肥,利用三维荧光(EEM)考察了温度对蚯蚓堆肥处理城镇污泥过程腐熟程度的影响,并采用PCR-DGGE技术探究了不同温度条件下蚯蚓堆肥微生物种群结构的变化,旨在分析蚯蚓堆肥中的微生物种群结构的变化,进而验证污泥中腐殖酸类有机物熟化降解机理,并为蚯蚓堆肥处理城镇污泥实现工业化生产提供理论依据。EEM分析结果表明:在堆肥30 d时,堆肥系统中腐殖酸类物质已基本降解完全,且随着堆肥时间的延长,芳香类蛋白质一直在被蚯蚓和微生物所利用;同一时期随温度升高,蚯蚓吞食和系统内的微生物的协同增效作用能加快系统中DOM的降解效率、提高系统的矿化程度。依据PCR-DGGE技术测序结果可知:蚯蚓堆肥系统中微生物种群对于温度变化存在缓冲区间,当温度在15—20℃范围内变化时,细菌和真核微生物的种群多样性差异均较小;温度为25℃时,系统中细菌种群多样性降低,真核微生物种群多样性升高;堆肥结束时,3个温度组系统中共有细菌种群类别占系统中总细菌种群类别79%以上,共有真核微生物种群类别占系统总真核微生物种群类别75%以上,表明随着温度升高系统中主要微生物种群类别并未发生变化,仅共有微生物种群的相对数量发生了改变,且3个温度组系统中均以拟杆菌门(Bacteroidetes)和子囊菌门(Ascomycota)为优势种群,温度越高,相对数量越多,系统中易利用有机质所占比重小,系统更加稳定。     

冶炼企业周边农田土壤的多环芳烃污染及其细菌群落效应

多环芳烃是一类持久性有机污染物,进入土壤后可能产生多方面生态效应。为研究多环芳烃对土壤微生物的影响,选取南京某冶炼企业周边农田样品,在分析污染物含量基础上,采用高通量测序、定量PCR等方法综合评价了土壤细菌多样性和组成以及多环芳烃降解细菌丰度等特征。17个土壤样品中,多环芳烃总量为0.25~31.08 mg·kg-1,并具有随污染源距离增加而降低的空间分布特征。与土壤理化性质如p H相比较,多环芳烃污染对土壤细菌的总体多样性和群落组成影响不显著。进一步分析发现多环芳烃与潜在降解微生物的相对丰度和降解功能基因(芳香环羟基化双加氧酶,PAH-RHDα)拷贝数显著正相关。污染较重样品的克隆、测序分析表明,土壤中PAH-RHDα基因主要属于革兰氏阳性细菌nid A3/fad A1类群,且与分支杆菌相关序列较为接近。这些结果综合评价了冶炼企业周边农田土壤多环芳烃污染对微生物群落的影响,提示土壤污染在多环芳烃潜在降解细菌中的富集作用,将为后续污染土壤生物修复提供重要科学依据。     

生物多样性的海拔分布格局研究及进展

生物多样性的海拔分布格局受制于气候、空间、环境等多种因子的影响,综合大量研究发现,无论是动植物还是微生物,环境因子对其影响与驱动的作用最明显。海拔梯度是决定分布格局的重要因素之一,因此探讨生物多样性在环境因子驱动下的海拔分布格局具有重要意义。文章分别探讨了植物、土壤动物和土壤微生物多样性沿海拔梯度的变化规律,揭示了温度、湿度及人为干扰等因素下植物多样性沿海拔梯度的5种分布格局及可能机制,土壤动物多样性沿海拔梯度的3种分布格局及可能机制,同时揭示土壤微生物在海拔分布格局虽然有物种模式,但是机制不是很明确;最后对植物、土壤动物、土壤微生物生物多样性耦合关系的认识作了阐述。并在此基础上,认为生物多样性的分布格局与尺度密切相关,因此开展不同尺度的生物多样性的研究以及它们对全球气候变化的响应是未来研究的重要方向;土壤动物群落的多样性的变化规律研究,应致力于其生理型、营养型、生态型的多样性的研究;在不同的研究尺度上,驱动微生物群落构建机制的差异导致了群落演变规律的变化,仍需要以地理学和生物学等相关学科理论为支撑,并与微生物群落构建理论相结合,对海拔分布格局下生物多样性的保护和生态系统稳定性研究提供科学依据。     

未培养微生物的培养方法进展

在自然界庞大的微生物资源中,传统条件下可分离培养的微生物仅占1%,绝大多数则是尚未在人工条件下获得生长活性的未培养微生物(Uncultured microorganism).未培养微生物的难培养在于无法全面掌握它们原位(In situ)生长的环境信息及在人工条件下的准确复制,从而阻碍了环境微生物的特性研究和资源开发.本文详细介绍了目前对未培养微生物原位生长信息的主要认知及限制实现条件,系统总结了当今未培养微生物的最新培养方法进展.以新型培养基、高通量和微流控等为代表的各种新型培养装置与技术的应用,显著提高了未培养微生物的分离及培养效率,分离出不同环境中的多种未培养微生物,例如肠道细菌Ruminococcaceae、浮游细菌Formosa和土壤细菌Candidate N.defl uvii等.分子生物学技术在近十几年快速发展和广泛应用,特别是通过高通量测序和宏基因组测序,在基因功能水平上探索微生物代谢途径和生理生化机制的研究,为快速寻找适宜人工培养条件、规避传统方法的长周期弊端提供了可能.总之,新培养技术的出现显著提高了微生物的可培养比例,基于分子生物学方法的研究结果不仅大大丰富了微生物资源库,为种群多样性的深入研究及在生态系统中的作用奠定了良好的基础,更是为今后微生物分离与培养技术的提高指出了明确方向.(图2参60)     

气态有机物组成对生物过滤及菌体密度的影响

以堆肥-火山灰为填料的生物过滤器连续处理含甲苯、乙酸乙酯和异丙醇的气体,观测生物过滤效果和填料的菌系状态变化.结果表明:在甲苯和乙酸乙酯共存的条件下,生物过滤器优先去除乙酸乙酯;当进气中同时存在甲苯、乙酸乙酯和异丙醇时,优先去除乙酸乙酯和异丙醇.填料中各种微生物的菌体密度与过滤去除的有机物组成和浓度有关.霉菌和酵母菌竞争利用乙酸乙酯和异丙醇的能力较强,放线菌和细菌对甲苯的竞争利用能力较强.进气中高浓度的有机物会使填料中的菌体密度增大.在处理甲苯、乙酸乙酯和异丙醇的生物过滤器的各段填料中,菌体密度按细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的顺序而降低. 图 1表 3参 17     

Distribution de certaines bactéries hétérotrophes aérobies dans les sédiments profonds de Méditerranée Orientale

Ninety five sediment samples were extracted from 16 cores collected at depths from 283 to 4,350 m in the Eastern Mediterranean Sea. Generally, the microbial population of superficial layers is lower than 10⁵ bacteria/g sediment. At depths below 1,000 m this population is lower than 10⁴. Bacterial counts at different levels of the sediment show that the microbial population is only important in the superficial layer. Below the surface, bacterial counts are generally between 10² to 10³ cells/ml. Some levels appear to be sterile; none of the 12 culture media gave rise to development with the sediment samples. Studies of some physiological groups of bacteria show scarcity of chitinoclastic and agarolytic bacteria and absence of cellulolytic and sulphate reducers. On the other hand, amylolytic, gelatinolytic, lypolytic and nitrate-reducing bacteria are widely distributed among the microbial population of marine sediments. This population of deep sediments includes a few auxotrophic bacteria.     

Soil bacterial community characteristics of rice-rice-rape crop rotation北大核心CSCD

To investigate the characteristic changes in soil bacterial community under rice-rice-rape rotation in southern China, soil samples from a 30-year crop rotation and continuous cropping system were collected. Clone library and gene sequence analysis were adopted. The PCR amplification was carried out using universal primers of the 16S rDNA gene. The amplified fragments were then used to construct a clone library. The subclones were sequenced and analyzed. The experimental analysis showed that, in July 2015, and October and April 2016, the Shannon Wiener index and richness index of bacteria from the rotation treatment soils were higher than those of the continuous cropping treatment soil. The soil bacterial diversity of the rotation treatment was higher than that of the continuous cropping treatment. The results of BLAST analysis in the GenBank showed that Proteobacteria accounted 55% of total bacteria in the rotation treatment soil, whereas it accounted for 45% of total bacteria in continuous cropping treatment soil. Gemmatimonadetes accounted for 13% of the total bacteria in rotation treatment and 10% in the continuous cropping treatment. The proportion of Acidobacteria, Firmicutes, and Planctomycetes in rotation soil was less than those in the continuous cropping soil. Proteobacteria and Gemmatimonadetes were the dominant flora in soil. The changes in the predominant bacteria affected the diversity of soil bacteria in rotation and continuous cropping. The sequence analysis showed that the dominant bacteria in the soil were Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, and Gammaproteobacteria, which higher than those in the rice-rice continuous cropping treatment. The sequences similar to Chloroflexi were observed in the rice-rice-rape rotation soils, but not in the continuous cropping soils. The results showed that the soil microbial population is conducted by agricultural tillage, and rice-rice-rape rotation increased the soil bacterial abundance compared with that of the rice-rice continuous treatment. © 2018 Science Press. All rights reserved.     

恩诺沙星对土壤细菌数量及微生物生物量碳的影响

为了评价兽药恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)对土壤微生物的影响,采用平板计数法和熏蒸浸提法研究了不同含量恩诺沙星(wENR)对土壤细菌数量和土壤微生物生物量碳(MBC)含量的影响.结果发现,添加药物组细菌数量和土壤微生物生物量碳含量均低于对照组,且药物含量越高,细菌数量和土壤微生物生物量碳含量越低;较低含量的恩诺沙星(wENR<0.1μg·g-1,细菌数量;wENR<1μg·g-1,MBC)对细菌数量和微生物生物量碳含量影响不显著(与对照组比较,p>0.05),而较高含量的恩诺沙星(wENR≥0.1μg·g-1,细菌数量;wENR≥1μg·g-1,MBC)则影响显著(与对照组比较,p<0.05).以上结果表明恩诺沙星残留可显著影响土壤细菌数量和微生物生物量碳含量,进而可能影响土壤特性和土壤的一些生态过程。     

不同浓度植物根系分泌物微生态效应研究

探讨夹竹桃(Nerium oleander)根系分泌物对土壤微生物量碳、呼吸强度等微生物学特征及土壤微生物群落功能多样性的影响,深入揭示夹竹桃根系分泌物的微生态效应,通过向土壤中添加植物根系分泌物溶液的方法,研究了不同浓度(CK,15 mL去离子水作为对照;LC,5 mL分泌物+10 mL去离子水;MC,10 mL分泌物+5 mL去离子水;HC,15 mL分泌物)的外源植物根系分泌物对土壤理化性质、土壤微生物群落功能多样性、微生物量碳、微生物熵、基础呼吸和代谢熵的影响。结果表明,不同浓度根系分泌物处理pH值显著低于CK(P<0.05);有机碳、含水量、全氮、碱解氮、速效磷含量显著高于CK(P<0.05),其大小表现为HC>MC>LC>CK;而土壤全磷无明显差异(P>0.05)。细菌、真菌、放线菌和微生物总数均显著高于对照(P<0.05),不同处理之间差异均显著(P<0.05),其大小表现为HC>MC>LC>CK。微生物量碳、微生物熵和基础呼吸均显著高于对照(P<0.05),不同处理之间差异均显著(P<0.05),其大小表现为HC>MC>LC>CK。土壤代谢熵表现为HC>MC>LC>CK,HC和MC差异不显著(P>0.05)。平均吸光值、物种丰富度指数、Mcintosh指数均显著高于对照(P<0.05),不同处理之间差异均显著(P<0.05),其大小表现为HC>MC>LC>CK。不同处理间优势度指数差异不显著(P>0.05)。主成分分析表明:中浓度根系分泌物处理的土壤与CK土壤微生物群落代谢特征相近,其明显不同于高浓度根系分泌物处理的土壤,说明它们对单一碳源的利用能力不同,其群落代谢特征存在差异。总体来看,高浓度的根系分泌物能够显著改变土壤微生物学特性及群落功能多样性。     

蛭石和沸石对番茄青枯病及土壤微生物的影响

施用沸石于番茄连作地，使番茄青枯病显著减少，但施用蛭石使番茄青枯病加重。施用沸石后土壤微生物生物量显著提高，而蛭石处理对土壤微生物生物量的影响不明显。沸石和蛭石都能提高土壤中真菌、细菌和放线菌的数量和土壤微生物活性，其中沸石处理的土壤高于蛭石处理的土壤。     

Possible role of marine bacteria in providing the creosote-resistance of Limnoria tripunctata

Electron microscopic examination of thin-sectioned Limnoria tripunctata from creosoted and untreated wood substrates from Panama, Florida, and laboratory aquaria, coupled with limnorian behavioral studies revealed that bacteria may contribute to the wood boring, nutrition, and creosote-resistance of these isopods. Ingested along with wood fragments and encased in a peritrophic membrane in the isopod intestine, these bacteria, upon lysis, may provide supplemental nutrition to the nitrogen-poor wood diet of L. tripunctata. Ingested material has never been observed in the digestive diverticula of limnorians and the presence of the peritrophic membrane in the isopod intestine has been correlated with feeding. Isopods from creosoted wood differed from those inhabiting untreated wood in that the former contained relatively larger and more diverse bacterial populations both on their exoskeletons and in their gut contents. These isopods harbored bacteria, which apparently bypassed the peritrophic membrane and lived in association with the isopod intestinal lining. These gut-associated bacteria were lost when laboratory isopods reared on creosoted wood were transferred to untreated wood. Laboratory isopods reared solely on creosoted or untreated wood were exposed to creosoted and untreated wood substrates, both sterilized and unsterilized. Boring and mortality data from these studies indicated that the creosote-reared population had a microbial flora whose activity facilitated isopod colonization of creosoted substrates. We present the hypothesis that creosote hydrocarbons provide nutrition for isopod-associated bacterial populations and that L. tripunctata may benefit from a concomitant bacterial detoxification of the creosote.     

景观人工湿地微生物群落结构的季节变化

采用PCR-DGGE技术对梦清园人工芦苇湿地不同季节的细菌群落变化进行了研究。结果表明,随着水体流动和季节更替,人工湿地中优势细菌一直在变化。测序结果显示芽孢杆菌在系统中较占优势,4个季节里都可以检测出来。恶臭假单胞菌在春夏秋3季比较有优势,而冬天枯草芽孢杆菌比较适合在该芦苇湿地中生存。经湿地处理后,水体细菌群落的多样性下降,相似性升高,部分细菌被淘汰出水体,但适应的细菌生长较快,整体细菌数量上升。对底泥的研究中,随运行时间的增加,进水口与出水口的细菌相似性分别下降,且进水口的相似性下降要明显快于出水口。     

施肥与设施栽培措施对土壤微生物区系的影响

微生物肥料的施用能显著增加土壤中放线菌的数量，而降低细菌和霉菌的数量；施用有机肥对土壤微生物有较大的影响，其中，有机肥与无机肥，有机肥与生物肥配合施用的影响尤为明显，与对照相比，土壤中细菌数量分别增加109．8％和405．0％，放线菌数量分别增加320．3％和215．0％，而真菌数量分别降低44．0％和47．2％。大棚栽培条件下土壤微生物数量高于露地；在大棚中，种植年限长的土壤微生物数量低于种植年限短的。