基于环境雌激素评估的卵黄蛋白原研究进展

卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)是卵黄蛋白(Vitellins,Vn)的前体.无脊椎动物的Vtg主要在肝胰腺、卵巢或脂肪体合成,脊椎动物主要在肝脏合成.在总结国内外相关研究基础上,对基于环境雌激素评估的Vtg研究进展进行了综述.目前的研究已经证明,Vtg的N末端氨基酸序列在动物进化中既具有高度的保守性,又具有一定的特异性.Vtg作为检测环境雌激素效应的生物标志物之一,在环境雌激素类化合物污染的评价中被广泛采用.Vtg的检测方法包括蛋白直接定量检测和mRNA定量分析,选择检测技术要依据实验设计,对于长时间的暴露实验,可通过检测蛋白来完成,短时间的暴露实验则适合半定量RT-PCR检测VtgmRNA的表达.在Vtg的检测中应考虑动物种属的特异性.     

2，4’-DDT对斑马鱼生长、繁殖力及卵黄蛋白原的影响

以斑马鱼体内卵黄蛋白原（Vtg）作为雌激素污染物的生物标志物,比较研究了不同浓度2,4。DDT对成年斑马鱼生长、发育、繁殖以及体内Vtg含量的影响。结果表明,当水环境中p（2,4。DDT）为2和10μg·L-1时,斑马鱼产卵量和受精率与空白和溶剂对照组相比均显著下降（P〈0．05）。当水环境中P（2,4。DDT）为0．2、2和10μg·L-1时,斑马鱼肝脏指数与空白和溶剂对照组相比显著升高（P〈0．05）;10μg·L。2,4。DDT处理组雄性斑马鱼体内Vtg含量显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05）,而0．2、2和10μg·L～2,4。DDT处理组雌性斑马鱼体内Vtg含量均显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05）,且随暴露浓度的增加而增大。SDS—PAGE检测及免疫印迹分析均显示雄鱼血液内出现Vtg特异条带,表明2,4。DDT对斑马鱼具有雌激素效应。     

多氯联苯对孔雀鱼卵黄蛋白原的诱导及检测

为探讨利用孔雀鱼(Poecilia reticulata)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)作为生物标志物检测环境雌激素的可行性,采用浸浴法分别使用17β-雌二醇(E2)和多氯联苯(PCBs)对雄性孔雀鱼成鱼进行染毒,30d后测定其性腺系数(GSI)和肝指数(LSI),并将鱼体整体匀浆进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及磷、脂和糖蛋白特异染色分析.结果表明,PCBs对雄性孔雀鱼具有雌激素效应,和E2均可以诱导雄性孔雀鱼体内产生Vtg,但诱导组雄鱼GSI及LSI与对照组比较均无显著性差异(p>0.05).Native-PAGE及磷、脂、糖蛋白特异性分析表明,孔雀鱼Vtg是一种富含磷、脂、糖的蛋白,具有VtgⅠ、VtgⅡ和VtgⅢ等3种形式,其分子量分别为642kDa、541kDa和441kDa.雄性孔雀鱼Vtg可作为环境雌激素监测的有效生物标记物.     

17β-雌二醇与1-萘酚对雄性罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）雌激素效应的比较

在实验室条件下,研究了暴露于不同质量浓度1-萘酚（0.064、0.8、2 mg.L-1）与17β-雌二醇（1、10、100μg.L-1）下,对雄性罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）性腺系数、血清雌二醇质量浓度的影响及血清中卵黄蛋白原的诱导效应,以期对它们的环境雌激素效应有所了解。研究结果显示：暴露于1-萘酚环境下30 d后,雄性罗非鱼的性腺系数有所降低,当质量浓度为2 mg.L-1时,与对照组相比,差异显著（p〈0.05）,雄性罗非鱼血清中雌二醇的量,此时亦达到最大值,为209.3 pg.mL-1,与对照组相比,差异显著（p〈0.05）;但是,血清中卵黄蛋白原并无变化。暴露于17β-雌二醇环境中的雄性罗非鱼,30 d后,其性腺系数有所降低,当质量浓度为10、100μg.L-1时,与对照组相比,差异显著（p〈0.05）;血清中的雌二醇也随着暴露质量浓度的增多,逐渐增多,当质量浓度为100μg.L-1时,差异极显著（p〈0.01）;血清中卵黄蛋白原的质量浓度明显高于对照组,与暴露质量浓度之间呈剂量效应关系。结果显示,17β-雌二醇具有很强的雌激素效应,会使罗非鱼性腺系数下降,诱导血清中雌二醇、卵黄蛋白原的生成;而1-萘酚会使罗非鱼性腺系数下降,诱导血清雌二醇的生成,但是并不诱导卵黄蛋白原的生成,所以推测其雌激素效应可能较弱,需要进一步研究。     

2,4'-DDT对斑马鱼生长、繁殖力及卵黄蛋白原的影响

以斑马鱼体内卵黄蛋白原(Vtg)作为雌激素污染物的生物标志物,比较研究了不同浓度2,4'- DDT对成年斑马鱼生长、发育、繁殖以及体内Vtg含量的影响.结果表明,当水环境中ρ(2,4'- DDT)为2和10 μg·L-1时,斑马鱼产卵量和受精率与空白和溶剂对照组相比均显著下降(P＜0.05).当水环境中p(2,4'- DDT)为0.2、2和10μg·L-1时,斑马鱼肝脏指数与空白和溶剂对照组相比显著升高(P＜0.05);10 μg·L-12,4'- DDT处理组雄性斑马鱼体内Vtg含量显著高于空白和溶剂对照组(P＜0.05),而0.2、2和10 μg·L-1 2,4'-DDT处理组雌性斑马鱼体内Vtg含量均显著高于空白和溶剂对照组(P＜0.05),且随暴露浓度的增加而增大.SDS - PAGE检测及免疫印迹分析均显示雄鱼血液内出现Vtg特异条带,表明2,4'- DDT对斑马鱼具有雌激素效应.     

唐鱼卵黄蛋白原的诱导、纯化与鉴定

为探讨利用雄性唐鱼(Tanichthys albonubes)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)作为生物标志物检测环境雌激素的可行性,采用浸浴法用50μg·L-117β-雌二醇(E2)对雄性唐鱼进行染毒,30d后将鱼体整体匀浆进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)以分析Vtg的产生;并采用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析对Vtg进行分离纯化.结果表明,E2诱导下,雄性唐鱼产生了雌性特异蛋白Vtg,并且可在体内积累;利用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析的两步纯化方法可分离纯化唐鱼整体匀浆Vtg;经Native-PAGE鉴定,确定唐鱼Vtg的分子量为440kDa.以上结果提示,雄性唐鱼Vtg可以作为环境雌激素监测的有效生物学标记物。     

浑河流域野生鲫鱼卵黄蛋白原基因表达

为揭示浑河流域水环境内分泌干扰物对水生态的潜在风险,利用兼并引物扩增获得鲫鱼卵黄蛋白原(Vtg)和核糖体蛋白L-7(RPL-7)基因部分碱基序列(分别为825和450bp),建立以RPL-7为内参基因、定量鲫鱼Vtg基因表达的实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法,并将该方法用于定量浑河野生鲫鱼肝组织Vtg基因表达分析。结果显示:与上游对照点(S1)相比,7月下游各点(S4～S8)雄鱼、S4和S6点雌鱼肝组织的VtgmRNA表达水平皆显著升高(P<0.05);11月在雄鱼中未检出VtgmRNA的有效表达,雌鱼也仅在S2和S3点的表达水平升高(P<0.05)。研究表明,浑河流域野生鲫鱼尤其是在7月明显受到了环境雌激素类物质的影响。另外,qRT-PCR方法能够灵敏检测出鲫鱼Vtg基因表达的时空差异。     

弱阴离子交换-超滤两级纯化浓缩真鲷卵黄蛋白原

利用弱阴离子交换色谱,从雌激素17β-雌二醇诱导的真鲷鱼血清中分离纯化出卵黄蛋白原粗组分,以超滤法进一步除去杂质蛋白,并脱盐浓缩,获得纯度较高的卵黄蛋白原(Vtg),两级纯化得到的Vtg经常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析,证实真鲷鱼Vtg有三种形式,分子量分别为665kDa,635kDa和355kDa;变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,它们由185kDa左右的蛋白亚基组成.     

西维因对雄性罗非鱼(GIFT Oreochromis niloticus)内分泌干扰效应的研究

在实验室条件下研究了西维因对罗非鱼的急性毒性以及在不同暴露浓度下的西维因(0.064,0.8和5mg·L-1)对雄性罗非鱼性腺系数、血清雌二醇、睾酮含量的影响以及对卵黄蛋白原的诱导效应,以期对其环境雌激素效应研究有所贡献。结果表明:西维因对罗非鱼的24、48、72和96h的LC50分别为30.21、25.16、19.76和17.86mg·L-1。长期暴露于低剂量的西维因中,会使雄性罗非鱼精巢系数降低;对其血清雌二醇的合成具有诱导作用,当浓度为0.8mg·L-1时,诱导作用最强,此时血清雌二醇的含量为218.83pg·mL-1;卵黄蛋白原的含量随着西维因浓度的升高,逐渐增多,当处理浓度为5mg·L-1时,达到最大为393.01μg·L-1;随着西维因浓度的升高,睾酮含量逐渐降低,西维因的浓度为5mg·L-1时,睾酮含量达到10.58mol·L-1,差异极显著(p<0.01),这可能是由于西维因对雄性罗非鱼具有雌激素效应。     

指示水生生态系统环境雌激素暴露的多种生物标志物的选择

废水中复杂的成分及其复杂的作用机制和外界的种种不确定性因素为水生生态系统中环境雌激素的风险研究造成了困难.文章介绍了用于指示环境雌激素污染的主要生物标志物以及与不同环境雌激素相应的生物转化酶,阐述了卵黄蛋白原、精子DNA损伤、细胞色素P450、谷胱甘酞S-转移酶及黄素单加氧酶等的生物化学响应原理、应用范围以及国内外最新研究进展.针对真实环境的雌激素复合污染现状,筛选一系列互补、敏感、准确、高效的生物标志物,研究它们的变化规律及其相互关系将有利于揭示环境雌激素的致毒机理,并在污染环境早期诊断和生态风险评价中发挥重要作用.     

苯并（a）芘对罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）肝细胞DNA损伤的影响

苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene,BaP）是一种含有5个苯环的多环芳烃,是环境中广泛存在的一类有机污染物,苯并（a）芘可引起多种形式的DNA损伤。彗星试验,又称为单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE）,是一项灵敏、快速的在单细胞水平检测DNA链断裂的技术,已经广泛应用于水环境的生物监测中。污染物的毒性监测与评估一直是环境科学研究的热点问题之一。本文通过生态毒理学试验,利用单细胞凝胶电泳技术,研究不同浓度苯并（a）芘暴露对罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）肝细胞DNA的损伤情况。试验将罗非鱼在0.1、1、10、50μg·L-14个苯并（a）芘（BaP）浓度下分别暴露4、7、14 d,利用彗星试验研究BaP对罗非鱼肝细胞DNA的损伤情况,以尾部DNA含量、尾长、尾矩及Olive尾矩为评价指标,结果表明,BaP会对肝细胞DNA造成不同程度的损伤：在0.1、1、10μg·L-13个浓度组,DNA损伤随着BaP暴露浓度的增加而增加,呈现一定的剂量效应关系,50μg·L-1组DNA损伤有所下降。在时间上,除1μg·L-1剂量组的尾部DNA含量、10μg·L-1组的尾部DNA含量及Olive尾矩外,其他指标有在第7天降低之后又升高的趋势,这意味着肝细胞DNA损伤可在一定程度上反映水体中BaP的污染情况。该实验为进一步探讨苯并（a）芘的致癌机制及环境中苯并（a）芘的监测提供一定的科学依据。     

壬基酚和双酚A对雄性斑马鱼(Danio rerio)卵黄蛋白原mRNA的诱导效应

为了对野外环境中内分泌干扰物更快速有效地进行检测,运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了17β-雌二醇(E2)、壬基酚(NP)和双酚A(BPA)对雄性成体斑马鱼肝脏合成卵黄蛋白原(VTG)mRNA的诱导作用,并初步探讨了VTGmRNA体内代谢动力学模式.结果表明,随着暴露浓度的升高(E2:20、100、250、500ng·L-1;NP:20、100、250、500μg·L-1;BPA:50、100、250、500、1000μg·L-1),VTGmRNA表达量均显著增加,VTGmRNA表达量与暴露浓度具有明显的剂量-效应关系.在10d的暴露期内,随着暴露时间的延长,VTGmRNA表达量均显著增加,VTGmRNA表达量与暴露时间呈明显的时间-效应关系;停止暴露后,VTGmRNA表达量迅速下降,E2诱导的表达消失得最快(4d),而NP、BPA诱导的表达持续时间相对较长(6d).     

环境雌激素o,p′-DDT和抗雌激素氟维司群对斑马鱼胚胎的复合效应

为探究雌激素与抗雌激素的复合效应,将斑马鱼(Danio rerio)的胚胎暴露于o,p′-DDT和氟维司群2种典型的环境内分泌干扰物中,考察胚胎孵化率、孵化时间和总畸形率,并用实时荧光定量PCR技术检测Vtg1、Vtg2和ERα等雌激素效应相关基因的mRNA转录水平.结果显示,与单一化合物的暴露相比,o,p′-DDT和...     

17α-甲基睾酮对稀有鮈鲫幼鱼性腺发育与血清卵黄蛋白原水平的影响

17α-甲基睾酮是一种人工合成雄激素,在水产养殖以及医药行业中广泛使用,其对鱼类的内分泌干扰效应研究工作相对较少.通过甲基睾酮对稀有鲫幼鱼的42天流水暴露,观察了其性腺发育和生物标记物变化.在500ng·L-1甲基睾酮暴露组中幼鱼生长受到抑制(p≤0.05),在50ng·L-1以上暴露组中性腺指数显著增加(p≤0.05),雄性个体比率明显升高.通过组织学观察发现,50ng·L-1以上浓度甲基睾酮暴露后卵巢组织切片中出现了精子细胞,且精子细胞数量随剂量的增加而增加.通过生物标记物卵黄蛋白原测定发现,在50ng·L-1以上浓度甲基睾酮暴露后,稀有鲫幼鱼血清中的卵黄蛋白原水平显著增加(p≤0.05).综合分析,17α-甲基睾酮主要表现出雄激素效应,而其在稀有鲫体内的代谢物则能够应激卵黄蛋白原,对稀有鲫幼鱼的最低可观察效应浓度(LOEC)为50ng·L-1.因此,仅依靠体内卵黄蛋白原应激单项指标不能准确判定化学品是否是环境类雌激素.     

城市污水处理厂进出水中类雌激素暴露影响评价

以稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）为模型动物,利用卵黄蛋白原（VTG）和生长发育指标作为类雌激素污染的生物标志物,评价了沙湖污水处理厂进出水中类雌激素暴露对稀有鮈鲫仔鱼的影响.结果表明：暴露21d后,未稀释进水和一级处理出水对稀有鮈鲫仔鱼VTG有显著诱导,各级处理水对稀有鮈鲫的生长发育也造成了一定的影响,在进水和一级处理出水暴露组中有死亡现象发生.以17β-雌二醇（E2）为阳性对照,对稀有鮈鲫VTG的诱导作标准曲线,计算进水以及各级出水的类雌激素E2的活性当量,发现污水处理厂一级和二级处理工艺对污水的类雌激素活性的去除率分别为47%和95%以上.表明在现有污水处理工艺中,二级处理工艺可去除大部分的类雌激素,而一级处理工艺却不能有效去除类雌激素.     

黑鲷(Sparus macrocephalus)暴露苯并(a)芘后胆汁中代谢产物3-羟基-苯并(a)芘的剂量与时间-效应关系研究

通过实验室生态毒理实验,研究黑鲷(Sparus macrocephalus)暴露苯并(a)芘(BaP)后,鱼体胆汁中代谢产物3-羟基-苯并(a)芘(3-OH BaP)的剂量-时间-效应关系,结果显示:胆汁中3-OH BaP的浓度随暴露时间的延长呈现先上升然后在7d后开始逐渐降低的变化趋势; 胆汁中3-OH BaP浓度随暴露浓度的升高而不断升高,呈现明显的剂量-效应关系.表明胆汁中的3-OH BaP反映了环境中母体BaP的浓度,是一个有效的污染监测生物标志物,3-OH BaP对于较短时间BaP暴露具有很好的指示作用.     

DDT、苯并[a]芘暴露对阿部鲻虾虎鱼P糖蛋白mRNA表达的影响

建立了阿部鲻虾虎鱼(Mugilogobius abei)P糖蛋白(P-gp)mRNA荧光定量RT-PCR检测方法,利用该检测方法探讨不同时间、不同浓度DDT和苯并[a]芘(BaP)暴露对阿部鲻虾虎鱼P-gp基因表达的影响。结果显示,该检测方法能在低质量浓度污染物(0.01 mg·L-1DDT、0.005 mg·L-1BaP)暴露下检测到P-gp基因表达量的显著变化(P<0.05)。P-gp基因在正常阿部鲻虾虎鱼肌肉、肝脏、心脏、肠、脑组织中均有表达,在鳃、脾组织中没有检测到表达,DDT和BaP能诱导肝脏和脑中P-gp基因表达量升高。2种污染物暴露5 h均可诱导肝脏表达量的显著变化,随着暴露时间延长,表达量均升高,24 h达到较高表达量。低质量浓度DDT和BaP均能诱导肝脏P-gp基因表达,并呈现良好的剂量-效应关系,而高质量浓度均抑制P-gp的表达。DDT和BaP可影响阿部鲻虾虎鱼肝脏P-gp基因表达,其变化可作为生物标志物,来评价化学污染物对水生动物的生物学效应。     

双酚AF对雄性斑马鱼卵黄蛋白原水平与芳香化酶基因表达的影响

双酚AF(4,4'-六氟-2-二酚,BPAF)对生物有机体具有内分泌干扰作用。为研究低剂量BPAF对水生生物的效应,本研究选择成年雄性斑马鱼为研究对象,考察了0.005、0.05和0.5 mg·L~(-1)3种浓度BAPF暴露30 d对血浆中卵黄蛋白原(VTG)含量、2种卵黄蛋白原基因(vtg~(-1)和vtg-3)表达和2种芳香酶基因(cyp 19a与cyp 19b)表达的影响。结果表明:在0.005 mg·L~(-1)浓度暴露30 d后,血浆中VTG含量显著升高,随着暴露浓度的升高,促进作用不显著;BPAF暴露对不同组织中的4种基因存在不同的影响,0.005 mg·L~(-1)BPAF暴露可诱导脑部cyp19b、肝脏中cyp19a和性腺中vtg~(-1)、vtg-3和cyp19b基因表达;0.5 mg·L~(-1)BPAF暴露可导致肝脏中vtg~(-1)、vtg-3、性腺中cyp19a等基因显著上调。实验结果表明,BPAF具有雌性激素样效应,可诱导雄性斑马鱼体内部分组织卵黄蛋白原基因和芳香酶基因的表达。BPAF可引起斑马鱼血浆中的VTG含量的上升,从而干扰由VTG所参与的下丘脑-垂体-性腺轴与免疫系统的正常生理过程。     

三种磺胺类药物对罗非鱼肝脏组织中谷胱甘肽转移酶（GST）和丙二醛（MDA）的影响

研究磺胺嘧啶（sulfadianzine,SDZ）、磺胺二甲基嘧啶（sulfadimidine,SM2）和磺胺甲基异恶唑（sulfamethoxazole,SMZ）三种典型磺胺类抗生素对罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏谷胱甘肽转移酶（GST）活性和丙二醛（MDA）含量的响应。采用饲料暴露的给药方式,用磺胺药物浓度为4和40g·kg-1的人工配合饲料喂养试验罗非鱼,对照组投喂不含磺胺药物的空白饲料。暴露时间为7d,每天2次投喂饲料,饲料的日投喂量按鱼体重的3%计,分别在24、72和168h采集肝脏样品待测。结果表明各浓度组GST和MDA分别在暴露后72和24h受到最大程度的诱导,其中GST活性比空白组提高了6.72倍,MDA含量比空白组提高了24.75倍。在4g·kg-1的药物浓度下SM2对GST和MDA有最强诱导,在40g·kg-1的药物浓度下三种药物对罗非鱼GST和MDA诱导效应大小顺序为SDZ〉SMZ〉SM2。GST和MDA在磺胺药物诱导下的响应敏感,适合作为磺胺类药物暴露的生物标记物。     

镉胁迫下黑点青鳉(Oryzias melastigma)肝脏金属硫蛋白mRNA性别差异性表达研究

鱼类金属硫蛋白(metallothionein,MT)mRNA作为生物标志物已越来越多地应用到水环境重金属污染的监测中,然而重金属胁迫下鱼类MT mRNA表达是否具有性别差异性特征目前尚无相关报道。以海洋模式鱼类—黑点青鳉(Oryzias melastigma)为实验鱼类,首次克隆了其MT基因全长c DNA序列,分析了黑点青鳉MT基因和氨基酸序列特征,然后进一步研究了水体中镉暴露后雌、雄性黑点青鳉肝脏中MT mRNA表达的差异性。结果显示,黑点青鳉MT基因c DNA全长为385 bp,编码60个氨基酸,预测编码的多肽分子量为5 990 Da,含有脊椎动物MT基因特征性序列结构cys-x-cys、cys-x-x-cys和cys-x-cys-cys。镉胁迫下雌、雄性黑点青鳉肝脏MT mRNA表达结果显示,在0.8,4.0和8.0μg·L-1环境浓度的镉暴露1~7 d条件下,与对照组相比,雄性黑点青鳉在所有的不同暴露浓度和不同暴露时间的实验组中肝脏MT mRNA几乎均被显著性诱导表达;而雌性黑点青鳉只在较高暴露浓度和较长暴露时间的实验组中才被显著性诱导表达,并且MT mRNA的表达水平比雄性低得多。上述研究结果表明,在相同的镉胁迫条件下,雄性黑点青鳉肝脏MT mRNA的表达比雌性更敏感;以黑点青鳉MT mRNA作为生物标志物监测海洋环境重金属污染生物效应状况时,应选择更敏感的雄性黑点青鳉作为监测鱼类。利用生物标志物监测水环境污染物生物效应时,监测动物的性别差异是一个应当考虑的重要因素。