紫云英根瘤菌的系统发育多样性

在筛选根瘤菌与不同紫云英品种高效结瘤的基础上,通过16S rRNA基因序列分析,对13株共生结瘤效果好的菌种进行了系统发育研究.结果表明,13株菌属于3个主要聚类群,分别与Mesorhizobium、Agrobacterium和Stenotrophomonas亲缘关系最为接近,种类多样性较为丰富;其中编号为ACCC13065株的菌株与S.rhizophila16S rDNA序列相似性为100%,位于γ-变形菌纲,这是除α-变形亚纲、β-变形亚纲外所发现的一类新的根瘤菌类型.     

四川省部分豆科植物根瘤菌的遗传多样性

从四川省豆科植物鸡眼草属、合欢属、豇豆属、葛属、金合欢、杭子梢分离获得了103株根瘤菌,采用AFLP、BOXAIR-PCR研究了这些菌株的遗传多样性.结果表明,分离自四川省豆科植物6个属的根瘤菌存在明显的遗传多样性,AFLP分析中,全部供试菌株的相似性为21%,全部供试菌株可分为26个AFLP遗传群;BOXAIR-PCR聚类分析结果表明,103个菌株分在70%相似性水平处,供试菌株被分为18个BOX遗传群.除部分菌株外,多数根瘤菌按宿主类型聚群,同一宿主而地理来源不同的根瘤菌分布于不同的遗传群,表明宿主和地理环境对根瘤菌具有深刻影响.图3表1参9     

四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析

为了解四川地区结瘤大豆根际土壤是否存在与紫云英、苜蓿和三叶草共生结瘤的根瘤菌及其多样性,从四川盆地采集不同种植模式下结瘤大豆根际土壤样品31份,利用紫云英、苜蓿和三叶草进行盆栽捕获试验以获得共生根瘤,从根瘤中分离纯化出根瘤菌,对其进行表型和分子鉴定;并将根瘤菌回接到紫云英、苜蓿、三叶草和大豆根际以检测根瘤菌的寄主范围.在捕获实验中,苜蓿和三叶草分别在6个土壤样品中共生结瘤,而紫云英只在2个土样中共生结瘤,并从共生根瘤中分离出14株根瘤菌;16S r DNA基因序列的相似性分析表明这14株根瘤菌均属于根瘤菌属(Rhizobium),且16S r DNA基因的系统发育树揭示它们分属于根瘤菌属的不同种;这14株根瘤菌在回接实验中都只能让捕获豆科植物结瘤,而不能让其他3种豆科植物结瘤.本研究结果表明,四川地区结瘤大豆根际土壤中的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)和三叶草根瘤菌(R.leguminosarum var.trifolii)资源较少,其与大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)分属于不同的属,且根瘤菌的回接实验进一步证明了根瘤菌的寄主专一性.     

应用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术验证含羞草根瘤菌的结瘤能力

对云南省热带及亚热带地区的含羞草根瘤菌进行了分离,选择其中40株菌为接种菌株,通过结瘤试验并采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记方法研究了其结瘤能力.经过结瘤试验,发现除菌株SWF66075和SWF66093没有结瘤外,其它38株菌株均与含羞草植物结瘤.结瘤率为95%.从结瘤试验所获根瘤中,分离得到结瘤菌株,采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较研究.蛋白图谱及聚类分析显示,26株接种菌株与其结瘤菌株的全细胞蛋白分子图谱完全相同,在100%的相似水平上与其结瘤菌株聚在一起,说明宿主植物所形成的根瘤确系接种菌株侵入所致,因而可将这些菌株确认为根瘤菌菌株;而SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等12株菌株的结瘤菌株与其各自接种菌株的全细胞蛋白图谱存在较大差异,推测这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不是同一菌株,尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力,这些菌株是否为根瘤菌菌株仍需进一步验证.研究结果表明,全细胞蛋向SDS-PAGE分子标记技术是一种快速、准确地验证根瘤菌结瘤能力的方法.该方法进一步完善了结瘤试验,并初步揭示了根瘤菌的竞争结瘤能力,适用于对大量根瘤内分离菌株进行根瘤菌的证实研究.图2参28     

用celB基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的可行性

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法，将celB标记基因分别导入了两株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中，对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明，二者之间没有显著差异．在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下，比较了二者的竞争结瘤能力；结果显示，标记菌株形成的根瘤（蓝瘤）的占瘤率与50％相比，差异不显著，为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性，测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量；结果表明，标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异．说明利用celB基因研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的，表5参7     

慢生型大豆根瘤菌的遗传多样性研究

采用选择性扩增片断长度多态性 (简称AFLP)DNA指纹技术对来自泰国北部的 2 45株慢生型大豆根瘤菌进行遗传多样性的研究 .通过AFLP图谱揭示出该地区的慢生型大豆根瘤菌有较显著的遗传多样性 .从 2 45株中选择出 92个代表株用计算机进行的树状图分析结果表明 ,所分析的菌株在 82 %的相似性水平上聚类成 8个群 .对这 92个代表株的部分菌株和慢生型大豆根瘤菌的参比菌株进行多聚酶链反应 (PCR)扩增的 16SrDNA的 4种限制性内切酶长度多态 (简称 16SrDNAPCR RFLP)分析 ,得出 2个不同的 16SrDNAPCR RFLP类型的菌株 ,分别与慢生型大豆根瘤菌的参比菌株Bradyrhizobiumjaponicum和Bradyrhizobiumelkanii相同 .图 1表 2参 14     

四川攀西干热河谷区根瘤菌的多样性研究

采用数值分类、BOXAIR-PCR和16S rDNA PCR-RFLP方法,对分离自四川攀西干热河谷区11种豆科植物上的43株根瘤菌的表型和遗传多样性进行了研究.数值分类结果表明,攀西地区根瘤菌具有极大的表型性状多样性,在80%相似性水平上绝大多数供试菌株单独成群,能耐60℃(10min处理)的高温,在低温(10℃)或者低pH(4.0)条件下生长很差.与数值分类结果相比较,BOXAIR-PCR的分群结果更分散,说明供试菌株在遗传性状上也具有多样性.在数值分群基础上,选取15个代表菌株进行16S rDNA PCR-RFLP分析.结果表明,供试的15株代表菌株遗传差异明显,仅CCBAU61224与Rhizobium leguminosarum USDA2370T,CCBAU61303与Agrobacterium tumerfacienseIAM13129T具有相同的遗传图谱类型.数值分类和16S rDNA PCR-RFLP分析具有较好的一致性,BOXAIR-PCR适合于对根瘤菌种内菌株间的遗传多样性研究.图4表2参21     

我国蚕豆根瘤菌的多样性和系统发育研究

采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP等方法对分离自我国11个省的50株蚕豆根瘤菌及11株参比菌株进行了表型测定和遗传型研究,同时对5株蚕豆根瘤菌的代表菌株进行了16S rDNA全序列测定.表型测定的结果表明,在80%的相似水平上供试菌株分为4个群,各群间存在地区交叉;16S rDNA PCR-RFLP的聚类结果与数值分类的聚类结果有很好的一致性;IGSRFLP反映的多样性更明显,形成的遗传群较多,可用于菌株间的鉴别.实验结果表明我国蚕豆根瘤菌具有极大的表型多样性和遗传多样性.系统发育研究结果表明,蚕豆根瘤菌的代表菌株均位于快生根瘤菌属(Rhizobium)系统发育分支,与R.leguminosarum USDA2370的全序列相似性达99.9%,说明蚕豆根瘤菌属于Rhizobium,系豌豆根瘤菌的一个生物型.图4表3参12     

慢生根瘤菌DG的分离、鉴定及其与降香黄檀的共生关系

从大果紫檀根瘤中分离到一株慢生型根瘤菌DG,通过其形态特征观察、保守基因序列分析以及生物学特性研究等方面进行种类鉴定,通过结瘤试验了解DG与降香黄檀的共生关系,并探讨其共生固氮能力.16S rRNA、nifH和dnaK系统发育结果表明,该菌株与Bradyrhizobium elkanii同源性最高.菌株DG与B,elkanii USDA76T在碳源利用、抗生素抗性、耐受NaCl等生物学特性上基本一致,而且还能在pH 10.0下良好生长.结瘤试验显示,菌株DG能在降香黄檀根部结瘤;接种DG的降香黄檀幼苗植株的株高、干重以及全氮含量(P<0.05)显著高于对照处理,表明DG能与降香黄檀形成良好的共生关系,且具有高效的固氮能力.图4表2参27     

饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌的分离及多样性

从生长在湖北省几种不同土壤中两类饭豆(Vigna umbellata L.)的根瘤中分离、纯化并通过结瘤试验筛选出26株饭豆根瘤菌；对这些菌株和来自其它种属的8个参比菌株的培养特性、生长速度、耐酸碱性、生长最终pH值、耐盐性、天然抗药性、碳源和氮源的利用及部分快生型菌株质粒图谱进行了系统的比较研究，并通过聚类分析得到数值分类树状图谱。结果发现，分离自不同类型土壤中的饭豆根瘤菌具有较大的多样性，在77％的相似水平上，形成了三大类群，群Ⅰ为慢生型菌群，群Ⅱ与群Ⅲ为快生型菌群，在80％相似水平上各群又可进一步划分为不同亚群，而且亚群中部分菌株的相似性与地理来源有相关性。图2表4参13。     

潍坊、花园口土样中土著大豆根瘤菌的遗传多样性研究

采用１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ间隔区段（ＩＧＳ）ＲＦＬＰ分析和ＰＡＰＤ分析技术，分别对分离自山东潍坊和河南郑州花园口的２４株土著大豆根瘤菌进行２多样性分析。结果一 ７０％的相似性水平上，依ＩＧＳ－ＲＦＬＰ分析可将供试菌株分为１０群，依ＲＡＰＤ分析可将供试菌株分为８群。综合两种分析技术在５０５的相似性水平上将供试菌株分为潍坊群和花园口群。 在系统发育和分子进行上有明显的地理分隔作用。     

花生根瘤菌的生长特性和脂肪酸组成研究(英文)

用73株慢生根瘤菌B．Japonicum、B．elkanii和B．"intermedium"为对照．对22株花生根瘤菌的生长速度、产碱能力和细胞脂肪酸组成进行了测定．结果表明：花生根瘤菌属于慢生根瘤菌属（Bradyrhizobiumsp．arachis）；除花生根瘤菌含有比大豆根瘤菌（B．japonicum）较高的脂肪酸16：1w5c（16个碳原子1个双键的脂肪酸）而外，花生根瘤菌与大豆根疚菌相似，表明了他们在系统发育及进化方向上的一致性．细胞脂肪酸分析法是根瘤菌系统发育研究中一种简便而可信的方法．     

DNA同源性分析最终确定新疆中华根瘤菌（Sinorhizobium xinjiangensis）为一独立种

针对S.xinjiangensis分类地位的争议，从新疆再次分离获得34株快生大豆根瘤菌，在16SrDNAPCR-RFLP分析和SDS全细胞蛋白电泳分群的基础上，进行了16SrDNA全序列相似性和DNA同源性分析.所测4个菌株和S.fredii模式菌株USDA205的16SrDNA全序列有很高的相似性.而DNA同源性分析说明新分离的菌株代表与原定的S.xinjiangensis为一个DNA同源群.其模式菌株CCBAU110与S.fredii的2株参比菌株USDA194、2048之间的DNA同源性分别为31.5%和28.7%.S.fredii的模式菌株USDA205与新分离的菌株代表及原定的S.xinjiangensis的模式菌株和2个参比菌株之间的DNA同源性为20.8%～39%，远低于70%.属于种水平上的差异.按照国际细菌分类委员会以DNA同源性≥70%且△Tm≤5℃作为定种的标准，S.xinjiangensis是Sinorhizobium属中不同于S.fredii的一个独立的种.表3参20     

基因间隔序列(ITS)在细菌分类鉴定和种群分析中的应用

Use of 16S -23S intergenic transcribed spacer (ITS) variability, as a relatively new method, is becoming an important supplement to the molecular methods based on 16S rRNA for which has a fairly constant size and is not divergent enough to give good separation in close relationships. This paper summarizes the structures and characteristics of ITS regions that are extremely variable in copy number, length and sequence per genome. The ITS region can be amplified easily taking advantage of conserved nucleotide stretches at the 5′of the 16S and 3′of the 23S gene, and the amplicon can contain different amounts of the 16S rDNA by choosing primers at different conserved areas within this gene. These primers are listed and discussed for perfecting the methodology of ITS. Furthermore, some recent progresses on the taxonomy, identification and community analysis of bacteria by means of ITS in epidemiology, ecology and artificial environment are reviewed, as well, the virtues and limitations of that method are discussed. Fig 2, Tab 1, Ref 51     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

内蒙古中东部地区几种豆科牧草根瘤菌的表型多样性及水分梯度对其分布的影响

选用101株分离自扁蓿豆、胡枝子、野豌豆、锦鸡儿属植物的根瘤菌菌株，进行了营养利用、抗生素抗性、耐逆性和酶活性测定等84个表型性状分析，发现分离自同种寄主植物的根瘤菌由于地理来源的不相同而存在着较大的多样性．通过数值分类，各已知种分别聚群，101株未知菌在84％的相似水平上分为4个各不同的群．根据1、2、3、4群菌的聚类情况，结合在不同水分梯度下采集的豆科牧草根瘤菌，结果发现除个别菌外，绝大部分菌株呈现随着水分梯度的不同，各菌以类群形式分布．证明土壤中水分含量对根瘤菌的分布有很大影响．     

Development of a PCR strategy for thraustochytrid identification based on 18S rDNA sequence

The identification and characterization of the thraustochytrids, an emerging economically and biotechnologically important group of marine heterotrophic protists, is usually based on morphological characters. In this research we used molecular markers to identify thraustochytrids. We designed three sets of primers based on the 18S rDNA sequence alignment of known strains and employed a PCR (polymerase chain reaction) strategy to identify unknown thraustochytrid isolates. DNA from 26 thraustochytrids (three isolated from primary cell cultures of the tunicate Botryllus schlosseri and 23 from a coral holding aquarium) were amplified by these primers, revealing 21 isolates with three bands each, which were assigned to two groups according to PCR fragment sizes. Taxonomic characterizations were deduced by comparing with GenBank data. Four isolates were further studied by sequencing their 18S rDNA. Sequence alignments and phylogenetic analysis revealed that isolates from the coral aquarium (7-5 and 8-7) were highly similar to each other and 95.0-97.0% similar to Thraustochytrium multirudimentale and Schizochytrium minutum. Isolates from the tunicate primary cell cultures (BS1 and BS2) were also closely related to each other and 84.3-86.0% similar to labyrinthulid quahog parasite and Thraustochytrium pachydermum. AFLP (amplified fragment-length polymorphism) analysis revealed 2.5-3.6% differences within the genomic DNA of each group, showing that each isolate is different, although isolates within each group may belong to the same species, in spite of differences found in the general morphology.     

慢生花生根瘤菌的遗传多样性研究

用ＲＥＰ１Ｒ１和ＲＥＰ２１ＤＮＡ为引物，对２２株四川土著慢生花生根瘤菌染色体ＤＮＡ的基因外回文重复序列（ＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅＥｘｔｒｏｇｅｎｉｃｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅＲＥＰ）进行了ＰＣＲ扩增和凝胶电泳，并对电泳结果的指纹图型进行了相似性聚类分析．结果表明了四川土著慢生花生根瘤菌的遗传多样性．指纹图形是根瘤菌多样性研究中一种简便而有效的方法