黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及表达

从曲霉属10株试验菌中筛选得到一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉FTA-008.该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活性达2.89 U/mL,适宜产酶周期为3 d.通过设计特异引物,以该菌株的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为2 511 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中AJ132386的β-葡萄糖苷酶序列相比,氨基酸序列同源性达96.8%.经毕赤酵母表达,β-葡萄糖苷酶比活力达7.85 U/mg.图3表1参13     

产纤维素酶菌株的选育分析及发酵工艺优化

对实验室6株产纤维素酶菌株进行酶活特性研究.首先通过观察纤维素平板的酶溶解透明圈大小进行初步分析,比较6株菌种子发酵液中纤维素酶含量.再根据不同种纤维素酶作用的底物化学键的不同,分别测定菌株的滤纸酶活(FPA)、纤维素内切葡聚糖酶(CMCase)活、纤维素外切葡聚糖酶(CBH)活和β-葡萄糖苷酶酶活,发现菌株中黑曲霉的各产酶指标均高于其它菌株.根据Box-Behnken原理对黑曲霉发酵工艺进行优化设计,得到最适碳源稻草粉含量9.47 g.L-1、麸皮含量49.33 g.L-1,氮源中(NH4)2SO4含量为2.0 g.L-1,发酵后黑曲霉产生的滤纸酶活力达到76.72 U.mL-1,比优化前酶活力提高88.69%.     

酶催化荧光法测定大气水相中过氧化氢

本文报道的酶催化荧光技术测定大气水相中H_2O_2,可以在野外采集样品,经简单前处理后带回中心实验室测定。方法的最低检测限为2×10~(-8)M,在1×10~(-7)M至2×10~(-5)MH_2O_2浓度范围内工作曲线呈线性,在2 × 10~(-6)M和1×10~(-5)M时的变异系数小于3.0％.若用流动注射方式工作,样品量小于1ml,2—3min 可以测定一个样品.     

一株白腐菌产生的漆酶对RB亮蓝的脱色作用

W 1是一株能在液体条件下产漆酶的白腐菌 ,纯化的漆酶对RB亮蓝有很好的脱色作用 .漆酶的最适脱色温度为 4 5℃ ,最适脱色pH值为 6 .0 ,脱色pH范围在 4～ 7之间 .当溶液中漆酶活力为 2 .0× 10 3 U/L时 ,在最适脱色条件下、16h内 ,RB亮蓝 (30 0mg/L)的脱色率可以达到 90 % .经酶作用后 ,RB亮蓝在 4 30～ 70 0nm范围内的特征颜色吸收峰基本消失 .实验证明 ,在相同的条件下 ,漆酶粗酶对RB亮蓝有更好的脱色效果 .图 7表 1参 6     

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)过氧化氢酶基因 perA ,将该基因与表达载体 pKK2 2 3 3连接构建重组质粒pK perA ,转化大肠杆菌过氧化氢酶HPⅠ和HPⅡ双缺突变株UM 2 ,得到重组大肠杆菌UM 2 1.酶活测定结果表明 ,表达产物具有正常的生物学活性 .SDS PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带 ,单体Mr =86× 10 3 ,与嗜热脂肪芽孢杆菌所产酶相同 .实验表明 ,重组质粒在宿主UM 2中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 6 0次基本保持稳定 ,传代 10 0次重组质粒保留 80 %以上 .摇瓶实验确定重组菌的最佳表达条件为 :IPTG浓度 ,0 .75mmol/L ;诱导时间 3h ;培养基起始 pH 6 .5 ;诱导温度 37℃ ;装液量 5 0mL/ 2 5 0mL .在优化条件下 ,重组菌产生的过氧化氢酶占菌体总蛋白的 8% ,酶活力可达 35U/mL ,是原始菌株BacillusstearothermophilusIAM110 0 1的 11.7倍 .图 2表 1参 10     

黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

产聚乙烯醇降解酶的培养条件

放线菌StreptomycesvenezuelaeGY1产生的聚乙烯醇(PVA)降解酶是一种诱导酶.以4种不同类型的PVA为唯一碳源时,该菌株单位质量细胞产酶能力比以糖类物质为唯一碳源时提高10倍以上.聚合度和醇解度最高的PVA1799是该菌株产生PVA降解酶的适宜底物,其浓度为1gL-1时,PVA降解酶的产量为120u/g(细胞).培养基中PVA1799浓度由1gL-1上升到5gL-1时,该菌株单位质量细胞产酶能力下降73%,表明PVA1799浓度过高会抑制产酶.GY1菌株产酶的最适温度和pH分别为30℃和7.0.在GY1菌株生长过程中控制以下条件有利于产生PVA降解酶:(1)保持培养体系中较高的溶氧水平;(2)在氮源中补充NO-3;(3)在一定浓度范围内添加MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、BaCl2、ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4等金属盐.Pseudomonassp.产生的PVA降解酶能够作用伯醇或仲醇类化合物,以这些伯醇或仲醇类化合物代替培养基中的PVA,不能诱导GY1菌株产生PVA降解酶;而在培养基中有PVA存在时,再添加0.5gL-1的3戊醇和环己醇能够明显促进PVA降解酶的产生(单位质量细胞产酶能力分别提高了21%和32%).图8表1参10     

青霉菌发酵生产β-葡萄糖苷酶培养基优化及纤维素酶可溶性诱导物制备

在纤维素酶生产过程中,常用的固体诱导物存在着诱导效率低、传质阻力大和不易于流加培养等局限性,所以利用β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖生产槐糖等可溶性诱导物进行纤维素酶发酵具有重要意义.为实现β-葡萄糖苷酶的低成本高效生产,首先利用本实验室分离的β-葡萄糖苷酶生产菌Penicillium sp.YH02为产酶菌株,利用响应面法对麸皮、麦草和微晶纤维素3个参数浓度进行优化,优化后β-葡萄糖苷酶酶活提高15.03%.其次,利用菌株YH02所产的β-葡萄糖苷酶,以高浓度葡萄糖为底物进行转糖苷反应,合成诱导里氏木霉(Trichodema reesei)产纤维素酶的可溶性诱导物.结果表明,以10 g/L该可溶诱导物为碳源时,里氏木霉Rut-C30在48 h时滤纸酶活比未进行催化反应的葡萄糖对照高24.9倍.离子色谱分析结果表明,高浓度葡萄糖经过菌株YH02分泌的β-葡萄糖苷酶催化后产生具有诱导能力的槐糖、龙胆二糖和纤维二糖.本研究实现了β-葡萄糖苷酶的高效生产并成功制备了可溶性诱导物,为降低纤维素酶生产成本提供了参考.(图4表1参22)     

由一株青霉菌产生的聚乙烯醇降解酶

从纺织污水活性污泥中筛选得到一株新型聚乙烯醇(PVA)降解酶产生菌,根据形态学特征鉴定该菌属于青霉属(Penicillium sp.),实验室编号WStt02-21.这是由霉菌产生PVA降解酶的首例报道.在考察了菌株WSH02-21基本生长和产酶特性的基础上,研究了营养条件对PVA降解酶合成的影响.通过对营养条件的单因素考察和正交试验,确定了最优培养条件为PVA 40 g L-1、葡萄糖3.0 g L-1、NH4Cl 8.0 g L-1、KH2PO4 2.0 g L-1、酵母膏1.0 g L-1、:MgSO40.5 g L-1。、CaCl2 1.0 g L-1、NaCl 0.02 g L-1、FeSO4·7H2O 0.02 g L-1,初始pH 6.4.其中PVA浓度是影响Penicilliumsp.WSH02-21合成PVA降解酶的最重要因素.采用最优化条件进行验证试验,PVA降解酶酶活(4.4 U mL-1)略高于正交试验中的的最高酶活(4.3 U mL-1).图7表2参11     

Thermobifida fusca产角质酶摇瓶发酵条件研究

研究了环境和营养条件等对嗜热放线菌Thermobifida fusca WSH03-11生长及产角质酶的影响;并考察了苹果角质对角质酶诱导效果,分析了该菌产角质酶的机理.摇瓶研究确定了角质酶发酵的最佳种子培养基组成为90 g L-1可溶性淀粉、5 g L-1牛肉膏、5 g L-1酵母膏、5 g L-1NaCl、2 g L-1K2HPO4和1%微量元素液,生物量最高达18.5 gL-1,种龄取35～40 h.最佳环境条件为pH 8.0、5%接种量、培养温度50℃.最佳发酵培养基组成为1.5%乙醇、5 gL-1蛋白胨、5 g L-1酵母膏、2 g L-1K2HPO4、5 g L-1NaCl和1%微量元素液.发酵培养基中添加角质对角质酶合成与分泌有诱导作用,T.fusca的产酶机制为诱导型.采用上述最佳培养条件产角质酶为3.8 U mL-1.图4表3参9     

Streptomyces venezuelae GY1产聚乙烯醇降解酶的培养条件

放线菌StreptomycesvenezuelaeGY1产生的聚乙烯醇(PVA)降解酶是一种诱导酶.以4种不同类型的PVA为唯一碳源时,该菌株单位质量细胞产酶能力比以糖类物质为唯一碳源时提高10倍以上.聚合度和醇解度最高的PVA1799是该菌株产生PVA降解酶的适宜底物,其浓度为1gL-1时,PVA降解酶的产量为120u/g(细胞).培养基中PVA1799浓度由1gL-1上升到5gL-1时,该菌株单位质量细胞产酶能力下降73%,表明PVA1799浓度过高会抑制产酶.GY1菌株产酶的最适温度和pH分别为30℃和7.0.在GY1菌株生长过程中控制以下条件有利于产生PVA降解酶:(1)保持培养体系中较高的溶氧水平;(2)在氮源中补充NO-3;(3)在一定浓度范围内添加MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、BaCl2、ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4等金属盐.Pseudomonassp.产生的PVA降解酶能够作用伯醇或仲醇类化合物,以这些伯醇或仲醇类化合物代替培养基中的PVA,不能诱导GY1菌株产生PVA降解酶;而在培养基中有PVA存在时,再添加0.5gL-1的3戊醇和环己醇能够明显促进PVA降解酶的产生(单位质量细胞产酶能力分别提高了21%和32%).图8表1参10     

高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及酶学、转酯特性

从自然环境中筛选水解酶活高且酶学、转酯特性优良的产脂肪酶菌株,对脂肪酶工业化发酵生产及生物柴油制备的研究具有重要意义.采用罗丹明B平板初筛和摇瓶发酵复筛法,从70份含油脂丰富的样品中筛选产脂肪酶酶活较高的菌株进行16S rRNA鉴定,研究其酶学性质;用大孔树脂固定酶,在无溶剂体系中催化橄榄油制备生物柴油,研究其转酯特性.结果筛选到一株高产脂肪酶的菌株WZ10-3,通过p-NPP法测得其初始酶活为78.68 U/mL,经16S rRNA鉴定属于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.),与B.stabilis同源性达到99%.该菌在发酵48 h时达到产酶高峰,所产脂肪酶的最适作用温度为50℃,最适作用pH为7.0,70℃下的半衰期可达1 h,pH为7-9时稳定性良好.以大孔树脂NKA-9和HPD600为载体制备的2种固定化脂肪酶,催化橄榄油生产生物柴油的转酯率均可达到97%.综合表明,菌株WZ10-3脂肪酶的初始水解酶活高于大多数野生脂肪酶,热稳定性好且转酯特性优良,有很好的后续研究价值.图7表3参25     

维生素C二步发酵中L-山梨糖脱氢酶的性质及作用

从氧化葡萄糖酸杆菌细胞质中分离纯化出L 山梨糖脱氢酶 (SDH) ,其分子量为 46× 10 3 ,表观分子量为 190× 10 3 ;在测试范围内 ,最适pH是 7.4,温度为 5 5℃ ,最稳定的 pH是 7.0 ,温度为 30℃以下 ;FeCl3 促进酶活 ,CoCl2 抑制酶活 .该酶活力与发酵产物 2 酮基 L 古龙酸的合成呈正相关 ;伴生菌促进产酸菌生长和代谢 ,并使该酶比活力增加 ,从而提高发酵系统中该酶的总活力 .图 11表 5参 9     

农药杀螟硫磷酶促降解的研究

从长期受农药杀螟硫磷污染的土壤中分离到一株高效降解菌株,研究了其最适产酶条件:培养温度为30℃,培养液起始pH为7.0,培养时间为30 h.从该降解菌中提取的粗酶液在pH 7.5和30℃时显示最大的降解活性,其米氏常数Km为2.92×10-4mol/L,最大降解速率为2 422.79 nmolm in-1mg-1.图7参15     

米曲霉产氨基酰化酶条件及部分酶学性质研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了米曲霉液态发酵产氨基酰化酶的最佳发酵条件.优化发酵培养基组成(ρ/gL-1):葡萄糖40,蔗糖10,可溶性淀粉20,蛋白胨2.5,马铃薯液1000mL,pH自然.培养基装量50mL/250mL三角瓶,接种量4%.培养温度30℃,转速100r/min,发酵时间42h.每50mL培养物的总酶活由优化前的2627u提高到7338u,是优化前的2.79倍.研究了米曲霉氨基酰化酶的部分酶学性质.该酶催化反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,低浓度的Co2 (5×10-4mol/L)对酶活激活作用显著.图5表2参8     

大熊猫肠道产果胶酶细菌的多样性及产酶特性

为探究大熊猫肠道微生物与消化的相互关系,利用果胶筛选培养基,从大熊猫新鲜粪便中分离具有产果胶酶活性的细菌,对获得的菌株采用生理生化特征和16S r DNA进行鉴定分类,探讨产果胶酶细菌多样性,并研究菌株的最适生长特性及产酶特性.共分离得到产果胶酶的细菌31株,属于志贺菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsilla)3个属,其中最高酶活为334.44 U/m L,最低酶活为15.6 U/m L.PF-4菌株具有最高的酶活,鉴定为肺炎克雷伯氏菌,生长温度范围为16-45℃,生长p H范围是5-8,最适产酶时间为24 h,最适产酶温度为37℃,最适产酶p H为6.结果为研究大熊猫消化系统中微生物果胶酶的来源及性质提供了参考.     

一株产木聚糖酶嗜热真菌樟绒枝霉的鉴定及其产纤维质降解酶系分析

对分离得到的一株产耐热木聚糖酶的真菌CAU521进行鉴定,并对其产纤维质降解酶系进行研究.通过菌落形态、显微镜产孢结构以及18S rDNA序列同源性比对等分析,鉴定该菌为樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea),其最适生长温度为45℃,为一株嗜热真菌.该菌能以农业废弃物玉米芯为碳源液体发酵产耐热木聚糖酶,50℃下培养7 d,木聚糖酶的最高酶活力达到173 U/mL.SDS-PAGE和酶谱分析表明该菌株能同时分泌多种纤维质降解酶:4种木聚糖酶、2种纤维素酶、3种葡聚糖酶和1种甘露聚糖酶.结果表明樟绒枝霉CAU521在降解和利用纤维质材料方面具有潜在的应用价值.     

高产木聚糖酶细菌的筛选、鉴定及其部分酶学特性

细菌木聚糖酶具有优良的酶学特性,发掘和研究高产菌株资源对促进木聚糖酶工业生产具有十分重要的意义.采用刚果红透明圈法从采集的土样样品中筛选分离得到1株高产细菌木聚糖酶的菌株SD4-4,通过形态特征及16S r DNA序列分析进行鉴定,并以本实验室保存的细菌木聚糖酶工业生产用菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SL作为对照,对比研究SD4-4的产酶水平及酶学性质.结果表明,SD4-4为短小芽孢杆菌(B.pumilus),利用小麦麸皮摇瓶发酵,其上清酶活可达1 166.0 U/m L,而SL上清酶活为281.0 U/m L.SD4-4所产木聚糖酶作用最适温度约为50℃,最适p H约为5.0.粗酶液在30-50℃的环境下处理10 min,相对酶活均保持在90%以上;在p H 4.0的条件下处理30 min,相对酶活仍有76%,酸性环境下稳定性较好.因此,菌株SD4-4产酶水平高于对照菌株SL,酶学特性更为优良,工业应用前景良好,尤其在饲料添加剂行业具有较大的开发潜力.     

脆江蓠凝集素的部分性质及细胞凝集作用

脆江蓠藻体的磷酸盐缓冲液浸提液 ,经硫酸铵分级沉淀 ,再经DEAE -Sepharose和SephadexG 10 0层析纯化 ,得到脆江蓠凝集素 (GBL) .经测定该凝集素是一种分子量为 33.1× 10 3 ～ 33.8× 10 3 的糖蛋白 ,分子中含有 11%的中性糖 ,具有很高的耐热性 .GBL的凝血活性可被某些单糖或双糖及卵粘蛋白抑制 ,当浓度为 2 .34 μg/mL时引起兔红细胞凝集 ,浓度为 18.75 μg/mL时凝集绵羊红细胞 ,但对鸡、鸭、鸽子红细胞及人A、O、或B型血细胞没有凝集作用 .GBL能够凝集两种单细胞藻类 ,当浓度为 18.75 μg/mL时能凝集盐生杜氏藻 ,但藻细胞密度减少到 18.3× 10 4 /mL时不能发生凝集作用 ;GBL浓度为 9.37μg/mL时引起蛋白核小球藻凝集 ,但当藻细胞密度减少到 2 8.9× 10 4 /mL也不产生凝集反应 .GBL还能够凝集正常的枯草芽孢杆菌和经过热处理的酿酒酵母细胞 .图 3表 6参 14     

黑曲霉Aspergillsu niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为:中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15