强化丙酮酸-CO2途径对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中辅酶NADH的有效供给影响1,3-丙二醇的产量和得率,通过在K.pneumoniae强化丙酮酸-CO2途径,以提高胞内NADH水平和1,3-丙二醇产量.将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W3 03)的甲酸脱氢酶基因fdh1和K.pneumoniae的丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl B在K.pneumoniae中过表达,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径.结果显示,单独表达fd h1、pfl B和共表达fhd1、pfl B基因的克雷伯氏菌与出发菌株相比,胞内NADH含量明显增加,1,3-丙二醇产量分别提高了8%、12%、18%,摩尔转化率分别提高了7.3%、13.2%、19.5%,除乙酸外其他副产物都有不同程度的降低.本研究表明,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径提高了NADH的再生效率,促进了1,3-丙二醇的合成.     

产1,3-丙二醇新型基因工程菌的构建

以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中,往往由于还原力NADH的不足,限制了1,3-丙二醇的合成,引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积,进而抑制甘油脱水酶的活性,阻碍菌体的生长,严重影响1,3-丙二醇的合成途径.为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾,本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因,构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT,成功共转入E.coli JM109,得到可利用两种辅酶(NADH、NADPH)将片油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,发酵结果表明,1,3-丙二醇产量提高了28.6%.图6表1参17     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析

通过对野生克雷伯氏菌(Klebsiella)进行紫外诱变,获得一株耐高浓度甘油及高浓度1,3-丙二醇的突变菌株A-39-3,该突变株产1,3-丙二醇的量较野生菌株提高了58%,副产物2,3-丁二醇和乙醇的量分别降低了27%和19%.为探讨突变株高产1,3-丙二醇的原因,通过对突变菌株发酵过程中关键酶的酶活跟踪分析,发现1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力与野生菌株相差不大,甘油脱氢酶(GDH)的酶活力略有下降,而突变菌株的甘油脱水酶(GDHt)的酶活力明显高于野生菌株.并采用半定量RT-PCR方法,从转录水平上比较甘油脱水酶基因的差异,结果发现突变菌株A-39-3甘油脱水酶基因的相对mRNA转录水平是野生菌株K的2.58倍,分析说明该突变株1,3-丙二醇产量的提高与关键酶基因dhaB的mRNA转录水平关系密切.     

促进氰钴胺素转化为腺苷钴胺素的基因表达与鉴定

辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12.     

基于回补途径的TCA循环改造对克雷伯氏菌生长和甘油代谢的影响

回补途径和TCA循环在克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的中心代谢中扮演着十分重要的角色.通过过表达回补途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和柠檬酸(TCA)循环的关键酶柠檬酸合成酶(GLTA)将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和乙酰辅酶A节点的碳流引入TCA循环,以考察基于回补途径的TCA循环强化对K. pneumoniae生长和甘油代谢的影响.结果显示:单独过表达ppc或gltA基因,TCA循环还原和氧化分支的中间代谢产物琥珀酸和α-酮戊二酸分别增加了8.3倍和1.2倍,甘油利用能力明显增强,除2,3-丁二醇外,其他副产物积累量均有所下降,但1,3-PDO产量分别降低了23.3%、5.9%.共表达ppc和gltA基因后,与对照菌相比,生物量降低了35.7%,甘油利用能力进一步增强,1,3-丙二醇产量提高了10.2%,所有副产物积累量均有所减少;与单独过表达ppc或gltA基因相比,乙醇、乳酸、乙酸积累量未有明显变化,但生物量略有提高,2,3-丁二醇积累量显著降低.上述结果表明通过共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶强化TCA循环能够提高菌株的甘油利用能力,弱化副产物合成,强化1,3-丙二醇的合成.(图4表2参19)     

利用甘油脱水酶基因构建产3-羟基丙醛工程菌及其表达比较

3-羟基丙醛(3-HPA)是一种重要的化工产品,可由甘油经甘油脱水酶作用后生成.为获得产3-HPA基因工程菌,在已构建含甘油脱水酶基因及其激活因子大亚基质粒pEtac-dhaB-gdrA的基础上,构建了包含小亚基gdrB激活因子的重组质粒pEtac-dhaB-gdrA-gdrB.利用大肠杆菌通用tac启动子将该质粒在不同Escherichia coli BL21、DH5a及JM109中进行表达.阳性转化子经IPTG诱导后,提取总RNA,以cDNA为模板进行RT-PCR发现,目标基因在不同宿主都能较好转录.SDS-PAGE、酶活测定和3-HPA浓度测定结果表明,目标蛋白表达存在差异;酶活分别为4.7(±0.44)、3.5(±0.95)、8.1(±0.66)U/mg;发酵液中3-HPA的含量分别为0.012(±0.0044)、0.014(±0.003)、0.375(±0.018)g L-1,重组E.coli JM109/pEtac-dhaB-gdrA-gdrB具有较好的甘油脱水酶基因表达和产3-HPA性能.该基因工程菌与克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)相比,发酵副产物明显较少,有利于后期提取,为生产3-HPA提供了一条新思路.     

微生物对生物柴油副产物甘油的利用研究进展

许多微生物都可以利用甘油生产有价值的产品,因此微生物转化生物柴油废料中的粗甘油是解决副产物污染及提高经济效益的途径之一.本文综述了微生物转化甘油为1,3-丙二醇、丙酸、二羟基丙酮、丁醇等产品的研究,主要从微生物种类、产品的产量和转化率以及产品提取工艺等方面进行介绍和总结,并对今后如何利用生物柴油废液中的粗甘油为原料进行微生物发酵生产有价值的产品提出了设想.     

葡萄糖脱氢酶基因的缺失对Acetobacter sp.碳源代谢及3-羟基丙酸合成的影响

3-羟基丙酸(3-HP)是一种新兴的高附加值平台化合物,醋酸杆菌(Acetobacter sp.)可高效催化1,3-丙二醇(1,3-PDO)合成3-HP,但其膜上脱氢酶亦可将葡萄糖氧化使培养液酸化,菌体生长受限导致生物量较低.利用同源重组技术对葡萄糖脱氢酶(GDH)基因gdh进行敲除,并考察该基因缺失对细胞生长、碳源代谢及3-HP合成的影响. gdh基因敲除后混合(葡萄糖、甘油)碳源培养条件下菌体量较野生菌提高了1.72倍;碳流分析显示葡萄糖在膜上被GDH氧化生成葡萄糖酸,大部分葡萄糖酸最终被氧化为2-酮基葡萄糖酸,少量经戊糖磷酸途径(PPP)途径被分解,而甘油经磷酸化后进入中心代谢途径或糖异生途径.本研究表明gdh基因敲除后混合碳源培养可大幅度提高菌体量且可以保证较高的催化合成3-HP性能,可为改善醋酸菌碳源利用及催化性能提供理论基础.     

不对称还原α-氨基苯乙酮菌种的筛选及转化条件优化

芳香基手性胺醇是许多手性药物合成的重要手性砌块,生物催化不对称还原前手性酮是合成该类醇的重要方法之一.以α-氨基苯乙酮盐酸盐为模型底物从土壤中筛选获得两株能分别高立体选择性催化底物产生R型、S型相应醇的菌株,对映体过量值(e.e.)分别为99%和77%,编号为1403和4802,鉴定菌株所属为镰刀菌属和地霉属.对两株菌培养时期和转化条件的研究表明镰刀菌1403最适生长时间为24 h,最优菌体浓度20 g/L,最优底物浓度5 g/L;地霉4802最适生长时间24 h,最优菌体浓度80 g/L,最优底物浓度3 g/L.底物特异性研究表明,菌株1403和4802均可转化α-氯代苯乙酮、α-溴代苯乙酮、α-羟基苯乙酮和苯乙酮为相应醇,且以α-羟基苯乙酮为底物时,其产物均为S型,e.e.值达99%.     

罗伊氏乳杆菌中甘油脱水酶的催化特性及原位再激活

对罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)全细胞和粗酶液催化转化甘油和1,2-丙二醇进行比较,分析其底物转化特性;使用有机溶剂制备通透细胞,外源添加辅酶B12和ATP,探索L.reuteri胞内甘油脱水酶再激活机制.L.reuteri胞内存在依赖于辅酶B12的甘油脱水酶,1,2-丙二醇不会使甘油脱水酶全酶失活,而甘油会使全酶失活;其最适温度和最适pH分别为37℃和6.2;获得了制备L.reuteri通透细胞的最佳条件;向通透细胞添加辅酶B12和ATP均能促进甘油脱水酶催化甘油转化,辅酶B12仅与甘油脱水酶单酶结合形成具催化活性的全酶,而ATP能协助失活辅酶脱离全酶和失活辅酶再激活过程.L.reuteri与Klebsiella pneumoniae类似,胞内存在甘油脱水酶再激活机制,但来源于二者的甘油脱水酶氨基酸序列同源性较低.来源于L.reuteri的甘油脱水酶是典型的依赖于辅酶B12的甘油脱水酶,尽管其序列同源性与来源于K.pneumoniae、Citrobacter freundii的甘油脱水酶差异较大,但在胞内同样存在甘油脱水酶再激活机制,可利用该机制实现胞内甘油脱水酶原位再激活,进而达到重复利用的目的.     

高温条件下混菌发酵合成气产乙酸及其群落结构

合成气(主要包括CO、H_2和CO_2)通过生物转化生产高附加值的生物燃料和化学品已引起人们广泛关注,微生物菌群作为生物转化的酶催化剂对合成气发酵产物组成和效率十分关键.通过富集得到高温条件下分别稳定转化CO、甲酸钠和合成气的厌氧菌群,探究CO与甲酸钠转化菌混培物和合成气转化菌发酵合成气生成乙酸的能力,并分析其微生物群落结构.结果显示,CO-甲酸钠转化菌混培物与合成气转化菌在合成气发酵前期主要进行CO的产氢反应生成H_2和CO_2以及同型产乙酸反应生成乙酸,CO利用率为100%,CO反应速率分别为6.93和6.34 mmol L~(-1)d~(-1);随后同型产乙酸菌利用H_2和CO_2继续合成乙酸,两者的乙酸最大累积量分别为9.11 mmol/L和8.01 mmol/L.CO-甲酸钠转化菌混培物主要菌群为Thermoanaerobacterium、Romboutsia、Ruminococcus、Clostridium、Eubacterium、Moorella和Desulfotomaculum属,合成气转化混菌则主要含有Romboutsia、Thermoanaerobacterium、Moorella、Eubacterium、Acetonema和Clostridium属,其中同型产乙酸菌广泛分布于Ruminococcus、Clostridium、Eubacterium、Moorella和Acetonema属.本研究表明复配CO和甲酸钠转化菌可用于合成气高温发酵产乙酸,且转化能力优于合成气转化菌,结果可为合成气混菌发酵提供微生物资源和技术参考.     

氯化钠对乳酸合成己酸效能及功能微生物群落的影响

探究己酸功能菌群对NaCl的耐受浓度,以及在不同NaCl浓度条件下的己酸合成效能,为评估餐厨垃圾转化为己酸的潜力提供参考.为探究己酸功能菌群对NaCl的耐受浓度,以及在不同NaCl浓度条件下的己酸合成效能,从而为评估餐厨垃圾转化为己酸的潜力提供参考.通过批式试验研究不同浓度的NaCl(0、2、6、10、20和30 g/L)对以梭菌属第四族(Clostridium Ⅳ)为核心的混合菌群发酵乳酸合成己酸的效能以及群落结构的影响.结果表明,随着NaCl浓度从2-10 g/L的升高,己酸合成效能呈下降趋势,而短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)的浓度呈上升趋势;当NaCl浓度达到20g/L时,己酸合成停止,丙酸、丁酸和戊酸成为主要产物;当NaCl浓度达到30g/L时,丙酸成为最主要的产物,细胞浓度和总ATP浓度显著下降.对己酸发酵菌群的多样性分析结果表明,当NaCl浓度提高至10 g/L时,在系统分类的属水平上,与产己酸相关的Clostridium Ⅳ在整个菌群中的相对丰度由47.78%(空白)下降至35.06%(10 g/L),而另一种可能与产己酸相关的菌Pseudoramibacter比例则由0.04%上升至0.17%. NaCl浓度达到30 g/L时,与丙酸合成相关的菌Propionibacterium的相对丰度从0.006%(空白)上升至0.09%.本研究表明,对于乳酸合成己酸系统来说,NaCl是一种不利的影响因素,当NaCl浓度在6 g/L及以下时,己酸菌可以保持其功能,即将乳酸主要转化为己酸;当NaCl浓度提高至10 g/L及以上时,己酸合成受到抑制;结果可为羧酸平台技术应用于餐厨垃圾处理的实际工程提供科学依据和理论支撑.(图6表1参53)     

构建辅酶自循环系统全细胞催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇

S-2-氨基-1-苯基乙醇是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒剂等多种具有生理活性药物的合成.目前其合成主要通过化学手段,虽然工艺成熟,但反应条件剧烈,且会生成许多副产物.基于新鉴定的铜绿假单胞菌来源的ω-转氨酶,设计了一个结合新金色分枝杆菌来源的醇脱氢酶的级联酶催化体系,从而将较为廉价的苯基-1,2-乙二醇一步催化合成具有高附加值的S-2-氨基-1-苯基乙醇.为了解决级联催化过程中辅酶再生和氨基供体再生问题,在该级联体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶,构建一个封闭的氧化还原自循环系统,从而实现辅酶(NADP~+)和辅底物(L-Glu)的同时再生.最后将这3个酶串联表达在pETDuet和pACYCDuet质粒上,并转入大肠杆菌中,获得了重组菌Escherichia coli BL21(MPG).通过重组菌全细胞转化,结果显示在100 mL、pH 8.0的NH_4Cl溶液中,37℃条件下反应10 h后,OD_(600)=30的该重组菌可一步催化50 mmol/L苯基-1,2-乙二醇生成光学纯的S-2-氨基-1-苯基乙醇,转化率达到99.6%,产物的ee值 99%.本研究提供了一种高效经济催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇的方法,不需要受到辅因子供应不足的限制以及副产物的积累的影响.(图8表3参31)     

大熊猫肠道产果胶酶细菌的多样性及产酶特性

为探究大熊猫肠道微生物与消化的相互关系,利用果胶筛选培养基,从大熊猫新鲜粪便中分离具有产果胶酶活性的细菌,对获得的菌株采用生理生化特征和16S r DNA进行鉴定分类,探讨产果胶酶细菌多样性,并研究菌株的最适生长特性及产酶特性.共分离得到产果胶酶的细菌31株,属于志贺菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsilla)3个属,其中最高酶活为334.44 U/m L,最低酶活为15.6 U/m L.PF-4菌株具有最高的酶活,鉴定为肺炎克雷伯氏菌,生长温度范围为16-45℃,生长p H范围是5-8,最适产酶时间为24 h,最适产酶温度为37℃,最适产酶p H为6.结果为研究大熊猫消化系统中微生物果胶酶的来源及性质提供了参考.     

青稞β-1,3-葡聚糖酶II基因启动子的克隆分析及表达载体的构建

根据本实验室克隆并公布的藏青稞β-1,3-葡聚糖酶II(BGH II)基因序列,以藏青稞QB09基因组DNA为模板,构建DNA步移文库,并通过步移技术克隆出BGH II起始密码子上游调控序列BGHP. 鉴定和分析表明,BGHP具备大多数高等植物启动子的保守元件,预测它对BGH II基因的表达具有一定的作用.为鉴定BGH II基因的基本启动子元件,将基因5′侧翼序列做缺失片段分析,利用PCR方法从BGHP中得到3个不同大小两端带有Hind Ⅲ、BamHⅠ酶切位点的片段BGHP1、BGHP2和BGHP3,定向插入载体pMGFP4(pBI221改建,报告基因为GFP)中,取代原有的CaMV35S启动子,构建了由驱动报告基因GFP的植物表达载体BGHPV1、BGHPV2和BGHPV3,用于大麦的遗传转化,为进一步研究其功能奠定了基础. 图5 表1 参15     

青稞β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因启动子的克隆分析及表达载体的构建

根据本实验室克隆并公布的藏青稞β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(BGH Ⅱ)基因序列,以藏青稞QB09基因组DNA为模板,构建DNA步移文库,并通过步移技术克隆出BGH Ⅱ起始密码子上游调控序列BGHP.鉴定和分析表明,BGHP具备大多数高等植物启动子的保守元件,预测它对BGHⅡ基因的表达具有一定的作用.为鉴定BGHⅡ基因的基本启动子元件,将基因5’侧翼序列做缺失片段分析,利用PCR方法从BGHP中得到3个不同大小两端带有HindⅢ、BamH Ⅰ酶切位点的片段BGHP1、BGHP2和BGHP3,定向插入载体pMGFP4(pBI221改建,报告基因为GFP)中,取代原有的CaMV35S启动子,构建了由驱动报告基因GFP的植物表达载体BGHPV1、BGHPV2和BGHPV3,用于大麦的遗传转化,为进一步研究其功能奠定了基础.图5表1参15     

高效转化胆固醇菌株的筛选、鉴定及转化条件优化

胆固醇由甾体母核和侧链构成,是一种新的甾体资源.以胆固醇为唯一碳源的选择培养基,利用富集培养法从土壤中筛选出一株细菌,编号5901.该菌能够快速高效转化胆固醇,专一性生成4-胆甾烯-3-酮.经形态学观察和16S rDNA序列比对分析,该菌株为Rhodococcus sp.该菌株转化胆固醇的最优条件为:生长温度和转化温度均为30℃,初始pH 8.0.胆固醇质量浓度为5 g/L,反应24 h后,胆固醇转化率为95%.本研究表明,590 1菌株较之前报道的菌株,底物浓度高,转化速率快,也可以催化其它甾体化合物的3β-羟基氧化和5位双键位移反应,具有潜在的研究和应用价值.     

耻垢分枝杆菌中3-甾酮-Δ~1-脱氢酶对植物甾醇转化积累9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,分枝杆菌转化植物甾醇的过程中,9α-OH-AD的分解是导致其产率降低的一个关键因素,之前的研究已表明,3-甾酮-Δ~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ~1-dehydrogenase,KstD)在9α-OH-AD的分解过程中起着重要的作用.耻垢分枝杆菌mc~2155(Mycobacterium smegmatismc~2155)菌株基因组中存在6个编码3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因,通过对这6个脱氢酶基因分别进行外源表达和活性测定,发现只有KstD1、KstD2和KstD3具有脱氢活力;使用CRISPR-Cas12a辅助重组技术成功构建了失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株,结果显示单独失活基因kstD1能够产生9α-OH-AD,但随着转化时间的延长,9α-OH-AD会降解,无法积累,同时失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株以5 g/L植物甾醇为底物时,转化14 d内9α-OH-AD能够稳定存在,产物浓度达到2.86 g/L.可见,耻垢分枝杆菌mc~2155中kstD1基因对9α-OH-AD积累起关键作用,随着转化的进行和产物的积累,kstD2和kstD3的作用逐渐显现,同时失活3个3-甾酮-Δ~1-脱氢酶有效提高了菌种生产9α-OH-AD的稳定性和产率,本研究结果可为构建9α-OH-AD生产菌种及产业化应用奠定基础.(图6表5参30)     

一株高效不对称还原产生(R)-苯基乙二醇的菌株筛选、鉴定及全细胞催化体系

(R)-苯基乙二醇是合成许多光学活性药物的重要手性中间体,其制备具有重要的现实意义.以α-羟基苯乙酮为底物,从土壤中筛选得到一株能够立体选择性催化α-羟基苯乙酮产生(R)-苯基乙二醇的细菌菌株HBU-SI7.经形态学观察和16S r DNA序列分析,鉴定此转化菌株为红球菌属菌株Rhodococcus sp.菌株全细胞催化体系研究表明在邻苯二甲酸二丁酯-磷酸盐缓冲液(V:V=1:3)的两相催化体系下,菌体转化α-羟基苯乙酮的最优浓度为3.0 g/L,转化率高达96.2%,e.e值为99.3%.本研究建立的红球菌全细胞催化还原体系对(R)-苯基乙二醇的高效制备具有潜在的研究和应用价值.