BDE-28对斑马鱼核受体介导的内分泌干扰效应研究

2,4,4’-三溴联苯醚(BDE-28)在环境中普遍存在,且在长江流域多种水生生物中检出。目前,国内外对高溴代PBDEs(如BDE-47、BDE-99等)的水生脊椎动物内分泌干扰效应报道较多,而BDE-28的有关研究则相对较少。将斑马鱼胚胎暴露于2、20和200μg·L~(-1)的BDE-28后,借助q-RT-PCR方法对幼鱼8个重要受体包括雄激素受体(AR)、甲状腺激素受体(TR)、芳香烃受体(AhR)、雌激素受体(ER)、糖皮质激素受体(GR)、孕烷X受体(PXR)、盐皮质激素受体(MR)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)相关基因的转录水平进行了研究。结果表明,BDE-28暴露可导致AR、TR和Ah R的基因下调,其中核心受体AR和TR在低中高3种浓度下的下调倍数分别为3.03、2.64、10.10和2.21、2.18、2.31,芳香烃受体基因2(ahr2)在暴露于2和20μg·L~(-1)的BDE-28后,下调倍数分别为12.65和9.23,而雌激素受体(er1)基因在低中高浓度显著上调,上调倍数分别为12.29、12.67和15.87,雌激素受体(er2a)基因在2和20μg·L~(-1)BDE-28下的上调倍数分别为10.83和17.19。进一步采用分子对接和分子动力学模拟的方法研究BDE-28与AR、TR、Ah R和ER之间的相互作用。结果显示,BDE-28与这些受体通过疏水和氢键等相互作用稳定结合,动力学模拟后骨架原子的均方根偏差(RMSD)在5 ns后较稳定。由此可知,BDE-28通过AR、TR、Ah R和ER受体介导产生内分泌干扰效应。     

BDE-209和PCB153在致大鼠肝细胞DNA蛋白质交联(DPC)上的拮抗作用

多溴联苯醚(PBDEs)和多氯联苯(PCBs)都是为人熟知的持久性有机污染物,也同为室内半挥发性有机物(SVOCs)。由于二者结构类似,通常认为PBDEs具有和PCBs相似的毒性。染毒剂BDE-209和PCB153分别是PBDEs和PCB家族的主要同系物,并且同时存在于环境和人体组织中。实验以DNA蛋白质交联(DPC)为生物标志物研究BDE-209和PCB153单独及联合染毒的遗传毒性。对大鼠肝细胞在37℃下染毒1h。浓度设置如下:BDE-209(0、1、6.5、12μg.mL-1);PCB153(0、1、6.5、12μg.mL-1);BDE-209(3.25μg.mL-1)+PCB153(3.25μg.mL-1)。实验结果显示:与溶剂对照相比,测得DPC水平随BDE-209(或PCB153)浓度增大而显著增高(p<0.01);PCB153比BDE-209引起更高水平的DPC(p<0.05或p<0.01);联合染毒组的DPC水平显著低于PCB153组(p<0.01),但稍高于BDE-209组(p>0.05)。从以上结果可知,BDE-209和PCB153之间存在拮抗作用;BDE-209和PCB153具有遗传毒性,并且就致DPC作用而言,二者之间可能存在拮抗作用。     

十溴联苯醚在单次暴露的孕和非孕SD大鼠血液内的吸收分布

五溴联苯醚、八溴联苯醚被禁以后,十溴联苯醚（BDE-209〉97%）是现在唯一仍在全球范围内广泛使用的多溴联苯醚阻燃剂。BDE-209在环境介质和生物体,甚至人体的血液、母乳中普遍存在,而且BDE-209的环境含量呈上升趋势。在实验室条件下,BDE-209可以通过生物代谢,或光降解、热降解转换形成毒性更强的低溴代PBDEs、羟基甲氧基PBDEs、致癌物多溴二苯并二噁英/呋喃（PBDD/DFs）。所以BDE-209的环境行为及生物效应成为环境污染物领域研究的热点之一。目前,关于BDE-209对妊娠期生物体的暴露研究还是很少。研究了十溴联苯醚在单次暴露的孕和非孕SD大鼠血液内的吸收代谢。结果表明,BDE-209可以被孕和非孕SD大鼠吸收,孕和非孕SD大鼠血液中吸收的BDE-209都可以快速的排出。BDE209在孕和非孕SD大鼠体内存在脱溴代谢,主要的脱溴代谢物是3种nona-BDE（sBDE-206,-207,-208）和五种octa-BDEs（BDE-196,-197/204,-198/203）,其中3种nona-BDEs是主要的代谢物,而BDE-207是nona-BDEs中含量最大的单体。BDE-209及其脱溴代谢物nona-BDEs的清除速率,在SD孕鼠的体内快于SD非孕鼠,而且在暴露实验的后期还存在统计意义的显著差异性。     

颗粒物上十溴联苯醚的光降解反应

多溴联苯醚(PBDEs)是一类全球性的有机污染物,由于其持久性、毒性和潜在的生物累积性而备受关注.商业上主要使用的是十溴联苯醚(BDE-209),但是环境中检测出大量的较低溴代联苯醚,有可能来源于环境中BDE-209的光化学降解.研究在自行设计的光降解反应装置中,以太阳光和紫外灯(主波长为365 nm)为光源,对负载在硅胶和氧化铝上的BDE-209进行照射实验.光照6 h后发现,负载在硅胶上的BDE-209(0.2 mg·g-1)在太阳光照射下,半衰期为35 min,而在紫外灯下仅为10 min;在紫外灯照射下负载在硅胶和氧化铝上的BDE-209(0.4 mg·g-1)的半衰期为18 min.在不同光源或颗粒物中,BDE-209都发生了脱溴反应,生成较低溴代产物.暗反应表明,负载在硅胶和氧化铝上的BDE-209都没有发生光降解.这些结果表明,吸附在颗粒物气溶胶上BDE-209的光降解反应,可能是环境中BDE-209的一个重要归趋,同时,其产物可能是环境中低溴代联苯醚的一个重要来源.     

中华圆田螺对沉积物中十溴联苯醚工业品DE-83的生物积累与转化

为研究沉积物中十溴联苯醚(BDE-209)的生物有效性,将淡水生态系统中常见的底栖动物中华圆田螺(Cipangopaludina cahayensis)暴露于商品DE-83(主要包含92%的BDE-209、6%的BDE-206、1.5%的BDE-207和0.5%的BDE-208)染毒的沉积物,进行60 d养殖实验。根据暴露期间中华圆田螺体内PBDEs含量与同系物组成的变化,探讨了田螺对DE-83的富集动力学、积累常数以及可能发生的生物转化。实验结果显示,DE-83主要同系物均能够被中华圆田螺积累,但是生物有效性非常低,BDE-209、BDE-207和BDE-206的吸收速率常数(k_s)为0.029～0.042 d^-1,BDE-207 > BDE-206 > BDE-209。依据动力学参数推算的生物-沉积物积累因子(BSAF)非常低,分别为0.05(BDE-209)和0.02(BDE-206和BDE-207)。暴露20 d后,中华圆田螺体内有低溴代同系物检出,其含量随暴露时间延长而增加,说明BDE-209在中华圆田螺体内发生了生物转化。     

视黄酸和多溴联苯醚联合暴露对斑马鱼运动行为的影响

水环境中的多溴联苯醚(PBDEs)污染会对水生生物神经系统产生影响,而视黄酸(retinoic acid, RA)对机体的神经系统和肢体发育具有重要作用。本文研究了四溴联苯醚(BDE-47)或十溴联苯醚(BDE-209)单独暴露以及RA联合BDE-47或BDE-209暴露对斑马鱼运动行为的影响。研究表明在稳定光照、黑暗和光暗交替刺激3种不同环境条件下,5μmol·L~(-1)BDE-47和3μmol·L~(-1)BDE-209单独暴露均导致斑马鱼运动速度显著降低。当2 nmol·L~(-1)RA联合相同剂量的BDE-47或BDE-209暴露时,可使仔鱼在稳定光照和黑暗下的自由运动速度相对单独暴露时显著升高,在光暗刺激下的运动速度也比单独暴露时于一定程度上有所缓解。因此,视黄酸的存在可以对因BDE-47和BDE-209暴露引起的斑马鱼运动行为异常起到恢复作用,这种恢复作用的机制可能是通过中枢神经系统或感官系统发挥作用。     

BDE-47和BDE-209对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的抑制特性及分子作用力研究

多溴联苯醚(PBDEs)是应用广泛的溴代阻燃剂,其中2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE-47)和2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-十溴联苯醚(BDE-209)广泛存在于环境中。PBDEs具有神经毒性,但其致毒机制尚不明确。本文通过研究BDE-47与BDE-209对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响及二者与AChE相互作用的光谱分析,揭示BDE-47与BDE-209导致神经毒性的致毒机制。BDE-47和BDE-209在一定浓度范围内均能够抑制AChE分解乙酰胆碱;随着浓度的增加,两者的抑制率均呈现出先增加后降低的规律。BDE-47浓度为400μmol·L-1时抑制率达到最大,为22.3%;BDE-209浓度为200μmol·L-1时抑制率达到最大,为11.2%。相同浓度下,BDE-47对AChE的抑制率始终大于BDE-209,表明AChE对BDE-47更加敏感。荧光光谱分析结果表明BDE-47和BDE-209与AChE之间的相互作用均主要为疏水作用,同时不存在范德华引力作用;BDE-47与AChE的结合常数大于BDE-209与AChE的结合常数,表明BDE-47更易与AChE相互作用。此外,温度的升高不利于BDE-47和BDE-209与AChE之间相互作用。BDE-47和BDE-209抑制AChE活性很可能是导致神经毒性通路之一。     

十溴联苯醚（BDE-209）对成年大鼠甲状腺激素的影响

多溴联苯醚(PBDEs)是现代工业中广泛应用的溴系阻燃剂,PBDEs具有持久性有机卤素污染物(Organohalogen Contaminants,OHCs)和内分泌干扰物(Endocrine Disrupters,EDs)的化学物理特性.PBDEs的生物毒性也是国际上环境生态科学的关注热点.论文建立了十溴联苯醚(BDE-209)暴露剂量的成年大鼠模型,测定了不同暴露剂量的实验动物血清甲状腺激素(Thyroid hormones,THs)水平,初步研究了PBDEs污染物对生物体甲状腺激素的影响.BDE-209的量-效关系研究结果显示,TT4、FT4和TT3浓度均随着暴露剂量的提高而下降,这可能是BDE-209对甲状腺合成分泌T4、T3起到了抑制作用.不同BDE-209暴露剂量下,TT4~FT4以及TT4~TT3的正相关系数大于FT3~TT3以及FT3~FT4,这意味着BDE-209暴露对于T4从甲状腺激素转运结合蛋白(Transthyretin,TTR)的分离与脱碘过程影响不明显,而影响了结合态T3从TTR的分离过程以及FT4的脱碘过程,从而对甲状腺激素的平衡具有干扰效应.采用基准点分析法,研究了BDE-209对于甲状腺干扰相对效应的时间-效应关系,实验表明由于甲状腺的应激作用,对于毒物具有自我防御功能,BDE-209对甲状腺的干扰效应在5~8d后才有所显现,持续时间至少为14d.     

BDE-28及BDE-99对斑马鱼早期生命阶段HPT、HPG和HPA轴功能基因表达水平的影响

2,4,4'-三溴联苯醚(2,4,4'-tribromodiphenyl,BDE-28)和2,2',4,4',5-五溴联苯醚(2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether,BDE-99)在水环境中广泛存在,并且发现在我国长江下游鱼体内和底泥中检出含量较高。目前针对2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether,BDE-47)的水生生物内分泌干扰效应和机制报道较多,而对于检出水平较高的BDE-28和BDE-99的相关方面研究还比较缺乏。本文将斑马鱼鱼卵分别暴露于2、20和200μg·L~(-1)的BDE-28和BDE-99溶液中,借助q-RT-PCR的方法研究它们对斑马鱼幼鱼的下丘脑-垂体-甲状腺(hypothalamus-pituitary-thyroidal,HPT)、下丘脑-垂体-性腺(hypothalamuspituitary-gonadal,HPG)和下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)轴上50个基因的影响。结果发现,在受精后120 h(hours post fertilization,hpf)时,暴露于2、20和200μg·L~(-1)的BDE-28和BDE-99的实验组中斑马鱼HPT、HPG和HPA轴上相关基因的表达均受到影响,其中BDE-28主要导致三轴相关基因显著上调,而BDE-99导致三轴相关基因显著下调。BDE-28和BDE-99对斑马鱼早期阶段3个主要内分泌分子通路的影响将导致内分泌功能的改变,从而可能会对斑马鱼的后期生长发育产生影响。另外,主成分分析发现2种不同溴取代个数的PBDE类物质(BDE-28和BDE-99)通过不同的毒性机制对斑马鱼产生不良影响。     

多溴联苯醚对鲫鱼离体肝脏组织中CAT和GSH-Px的影响

以鲫鱼(Carassius auratus)为试验材料,研究了在离体条件下经不同质量浓度的2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE-47)和2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-十溴联苯醚(BDE-209)暴露后,鲫鱼肝脏组织中过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的动态变化.结果表明,采用质量浓度为0.10～10.00 mg·L-1的BDE-47和5.6～100.00mg·L-1的BDE-209分别处理鲫鱼肝脏组织30 min,0.10 mg·L-1 BDE-47和5.6 mg·L-1BDE-209试验组鲫鱼肝脏组织中CAT和GSH-Px活性与对照组相比无显著差异(P>0.05),其余各试验组的CAT和GSH-Px活性随BDE-47及BDE-209质量浓度的增加而逐渐下降,均与BDE-47及BDE-209的质量浓度呈明显的相关关系(P<0.01).这说明BDE-47和BDE-209对鲫鱼肝脏产生了氧化损伤,具有生化毒性影响.     

绿僵菌钙传感蛋白基因克隆及其与致病性的关系

通过筛选文库获得绿僵菌钙传感蛋白基因MaNcs1基因全长cDNA序列,并对其在致病过程中的作用进行了分析.结果显示,MaNcs1基因cDNA全长792 bp,开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸;采用RNA干扰技术下调该基因的表达后,对东亚飞蝗的生测实验表明,绿僵菌毒力显著下降,说明该基因与绿僵菌的致病性有关,为以后深入研究该基因的致病机制奠定了基础.     

水稻DDB1基因的表达特性及功能分析

利用RNA干涉技术构建水稻DDB1(Damaged DNA binding protein 1)基因不同启动子驱动植物表达载体,DDB1-RNAi和DDB1-glu-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入水稻愈伤,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,与野生型植株相比,两组转基因植株幼叶内DDB1的表达量...     

大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的克隆与表达

采用RTPCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增HO1基因,将该基因克隆进pGEMTeasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,分析基因,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子NisA的pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用Nisin诱导HO1表达,SDSPAGE和Westernblot分析、鉴定表达产物,并且用分光光度法测定工程菌表达的HO1活性为0.45nmolmg(protein)-1h-1.图5参18     

恒河猴piwil1基因的表达

为了解人类近亲恒河猴piwil1基因的结构、表达和功能差异,利用RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil1基因,并对其编码产物进行了相应的生物信息学分析,随后检测了piwil1 mRNA在成年恒河猴10种组织中的表达情况,最后利用免疫组化方法比较了PIWIL1蛋白在成人、成年恒河猴和幼年恒河猴睾丸组织中表达的异同.结果表明,恒河猴piwil1基因全长2 586 bp,编码861个氨基酸,氨基酸数目与人类piwil1基因相同.恒河猴PIWIL1蛋白与人的PIWIL1蛋白序列同源性达99%,均含有PAZ结构域和Piwi结构域.在成人和成年恒河猴的睾丸组织中,PIWIL1蛋白均在精母细胞和精细胞的胞浆中表达,而在幼年恒河猴睾丸组织中,PIWIL1表达与成年恒河猴相比存在差异,表达量相对较低,且主要表达于生精小管的细胞的细胞核上.上述结果提示,PIWIL1蛋白在成人和成年恒河猴可能具有相同作用,但是在不同的发育阶段中PIWIL1蛋白的功能不同.     

鼠Tcp11l1基因的结构与表达分析

为了分析鼠Tcp11l1基因的结构和表达,从小鼠睾丸组织总cDNA中扩增鼠Tcp11l1基因的开读框架(Open reading frame,ORF),定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建融合表达质粒pTcp11l1-EGFP,转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察Tcp11l1基因的亚细胞定位;设计跨小鼠Tcp11l1基因两个外显子的引物,RT-PCR分析此基因在小鼠各组织中的表达情况.并利用生物信息学的方法对鼠Tcp11l1基因的结构进行初步预测.转染pTcp11l1-EGFP后在胞质中能明显看到绿色荧光信号,而在胞核和胞膜中无绿色荧光信号,表明鼠Tcp11l1蛋白定位于细胞质;RT-PCR分析结果表明,鼠Tcp11l1基因在小鼠各组织中广泛表达.生物信息学结果表明,鼠Tcp11l1和鼠Tcp11的蛋白具有相同的TCP11结构域,不能确定是否存在跨膜序列.鼠Tcp11l1基因和鼠Tcp11基因具有相似的亚细胞定位和TCP11结构域,表明这两个基因可能具有相似的受体功能.但是与Tcp11特异表达于睾丸组织的延长精细胞和精子不同,Tcp11l1为广泛表达,说明Tcp11l1可能在多种组织细胞中发挥作用.     

转座子挽救法克隆鞘氨醇单胞菌CDS-1中呋喃丹水解酶相关基因

用含Tn5转座子的自杀性质粒pSC123诱变呋喃丹降解菌Sphingomonas agrestis CDS-1,获得失去呋喃丹降解功能的突变株CDS-M1.以pMD18-T为载体在E.coli DH5α中构建了CDS-M1的基因组文库,采用转座子挽救法对Tn5插入位点两侧翼的序列进行克隆与测序,根据测序结果(共4 551个碱基)设计引物,从CDS-1的基因组中扩增到同样大小的片段,把该片断克隆到广宿主载体pPZP201上,得到重组质粒pCDZ1,通过三亲接合的方法把pCDZ1导入CDS-M1中进行功能互补实验,结果显示CDS-M1的呋喃丹水解功能得到了恢复,表明该片断中包含呋喃丹水解酶相关基因.图7表1参14     

苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征

采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)定量检测转mCry1 Ac基因抗虫玉米Bt799在不同生育期不同植株部位的mCry1Ac蛋白含量。结果显示:mCry1 Ac基因在整个生育期玉米叶、茎、根和种子中均能表达,mCry1Ac蛋白含量为(0.82±0.10)~(15.83±1.77)μg·g-1;随着生育期和植株部位的不同,mCry1Ac蛋白含量呈现明显的时空动态变化,其中,叶、茎和根中mCry1Ac蛋白含量随转基因玉米生育期的推移均呈增加趋势,并均在完熟期达最高;在除苗期外的其他各生育期叶中mCry1Ac蛋白含量均显著高于其他植株部位,而在完熟期种子中mCry1Ac蛋白含量在各植株部位中最低,为(2.86±1.71)μg·g-1。     

gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10