土壤宏基因组文库中纤维素酶的筛选与鉴定

纤维素酶是最重要的工业用酶之一,已广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤和生物燃料生产等多个领域中.为挖掘微生物来源的纤维素酶,基于功能宏基因组学的方法,筛选云南土壤宏基因组文库获得具有纤维素酶活性的阳性克隆;通过构建亚克隆和测序分析确定纤维素酶的编码基因,将其克隆到表达载体上并转化到大肠杆菌中构建重组表达系统,诱导蛋白表达后对纤维素酶酶学性质进行分析.通过筛选约65万个文库克隆,获得一个有纤维素酶水解活性的克隆,预测该纤维素酶基因全长为1 419 bp,编码蛋白分子量(Mr)为50.99×103,蛋白的氨基酸序列与Rhizobacter sp.S-16中的内切葡聚糖酶有88.66%的相似性,蛋白同源比对结果表明该酶属于糖苷水解酶第五家族(GH5),将其命名为YNEG5;对YNEG5的生化特性进行分析,确定其最佳反应温度为66℃,最适pH为4.8,该酶热稳定性良好且对工业试剂尿素具有较强的耐受性.本研究基于功能宏基因组学技术获得一个具有工业应用潜能的纤维素酶,可为不可培养微生物中纤维素酶的挖掘提供参考.(图10表1参36)     

蔗糖富集环境土壤微生物宏基因组分析及蔗糖水解相关酶基因克隆

蔗糖水解酶是蔗糖转化生成生物质能源的关键酶,且还具有重要的转糖苷功能.针对蔗糖富集的土壤环境,利用未培养的宏基因组技术对蔗糖水解相关的酶基因进行克隆.首先使用微生态分子技术对蔗糖富集的土壤样品进行分析,在可信区间为95%的情况下,样品覆盖率为20%(C指数为0.2),Species richness指数为235.0,Shannon index为5.2889,说明这个蔗糖富集样品中的微生物来源具有广泛性.然后使用宏基因组技术构建这个土壤样品中微生物的DNA文库,成功构建一个包含约100000个克隆的大片段DNA Fosmid文库.对文库中的Fosmid质粒进行随机测序,发现质粒的外源DNA与已报道的DNA都没有同源性,文库所克隆的DNA都来源于仍没有被研究的微生物.使用蔗糖作为唯一碳源对文库进行筛选,获得了能水解蔗糖的克隆.在蔗糖水解能力最强的两个克隆中所包含的蔗糖水解酶与GenBank数据库中已知蔗糖酶的相似性分别为38%和68%.     

深海沉积物微生物宏基因组文库中IMP环水解酶的筛选及基因克隆

为了解嘌呤合成途径的关键酶——IMP环水解酶的多样性,从深海沉积物样品中提取总DNA构建Cosmid宏基因组文库,从中筛选出一个具有IMP环水解酶活性的克隆(CAIMP1).通过基因步移的方法从CAIMP1的约35 kb的插入片段中扩增出长度为1 599 bp的完整的IMP环水解酶基因,该基因包含MGS和AICARFT_IMPCHas两个保守结构域.活性检测结果表明CAIMP1克隆的发酵液上清具有较强的IMP环水解酶活性.该酶与数据库中收录的IMP环水解酶的氨基酸序列同源性较低,系统发育分析也表明该酶与其它参照序列亲缘关系较远,表明该序列可能为一个新的IMP环水解酶基因.     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16     

中度嗜盐菌Halomonas sp.BYS-1启动子的克隆和测序

提取了中度嗜盐菌Halomonassp.BYS1的基因组DNA,以甲基对硫磷水解酶基因(mpd)为报告基因,以启动子探针pUCmpd为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建了BYS1的启动子文库.通过筛选获得了17个阳性克隆,编号为P1～P17.测定了阳性克隆的甲基对硫磷水解酶(MPH)活性,结果表明,P3中mpd基因的启动子活性最强,它的酶活高达2554.3U/mg,而P17中mpd基因的启动子活性最弱,它的酶活只有68.3U/mg.对P3、P8、P17克隆中的重组质粒的插入片段进行了测序和在线启动子预测.图4表1参17     

黄孢原毛平革菌酵母双杂交cDNA文库的构建及应用

作为研究木质素降解系统的模式微生物黄孢原毛平革菌,迄今还没有蛋白-蛋白相互作用方面的报道.本研究利用酵母双杂交技术构建了低氮培养基中培养2d和3d的酵母双杂交cDNA文库,分别得到2.5×105和3.0×105个重组子.以14-3-3蛋白为钓饵筛选3d cDNA文库,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培养基平板上共获得了约600个单克隆,进一步分析发现,有30个克隆可激活3个报告基因.分离自这些克隆中的质粒DNA能转化大肠杆菌.利用HaeⅢ和Sau3AⅠ限制酶切分析可将它们分为4类.序列测定和同源分析结果表明,其中一类为14-3-3蛋白基因,提示14-3-3蛋白可形成二聚体,另外3类在GenBank没有明显同源的基因.通过SBASE网站预测,编号为Y2H333的克隆含有一个OB-fold核酸结合结构域(OB-fold nucleic acid binding domain).这些研究结果表明,所构建的黄孢原毛平革菌cDNA酵母杂交文库是成功的,14-3-3蛋白在黄孢原毛平革菌中能以蛋白-蛋白相互作用的形式发挥功能.图4表1参28     

海洋微生物来源的天然产物开发研究进展

综述了近年来海洋微生物来源天然产物研究的新进展,总结了该类天然产物的开发策略.通过对样品采用不同的预处理方式、不同的分离培养基以及新的培养方法,讨论如何获得海洋来源的特有微生物和增加海洋来源微生物类群的多样性.阐述了在海洋微生物天然产物的开发过程中,采用宏基因组技术及基因组测序等手段,来发现难培养或不可培养微生物中的天然产物以及处于"沉默"状态的天然产物.最后介绍了异源生物合成、组合生物合成以及核糖体工程等技术在海洋微生物天然产物开发和改造中的应用,并举例论述了海洋微生物天然产物的开发.     

西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

石油降解菌株G5 16S rDNA全序列的系统学分析

用PCR方法扩增了一株石油降解菌株G5的16S rRNA基因全序列，并对其进行了克隆和测序．对该序列在GenBank中的BLAST结果表明，所有与该序列高度同源的序列都是假单胞菌的16S rRNA基因．其中假单胞菌的代表菌株Pseudomonas aeruginosa，P．fluoroscens，P .putida，P.syringae的16S rRNA基因序列与G5的16S rRNA基因序列同源性分别为93．4％，98．4％，96．3％，97．5％．对G5和其他39株假单胞菌的16S rRNA基因序列进行聚类分析，获得的系统发育树与RDP(Ribosomal Database Project)报道的系统发育树基本一致，其中菌株G5与5株P．chlororaphis聚类在一起．图2参7     

活性污泥宏基因组芯片DNA的制备方法

宏基因组芯片的探针是通过构建环境DNA的宏基因组文库而获得的,为了获得理想的活性污泥宏基因组文库和宏基因组芯片探针,必须获得高质量的活性污泥DNA.本文作者采用8种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过比较DNA总量、纯度、完整性、是否含有PCR酶抑制剂、能否进行限制性内切酶酶切等指标来评价不同提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明,溶菌酶-SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提处理活性污泥所提取的总DNA效果最好,提取的DNA总量多、纯度高,DNA片段大于23 kb,无需进一步纯化就可直接进行PCR扩增反应或SauA Ⅰ限制性内切酶酶切,但DNA如果需要EcoRⅠ、HindⅢ等限制性内切酶酶切,则需采用Roche公司琼脂糖凝胶回收试剂盒将DNA进一步回收纯化.图7表3参14     

重金属暴露铜锈环棱螺全组织均一化cDNA文库构建及表达序列标签特征分析

构建cDNA文库是寻找生物新功能基因的有效手段.采用SM ART技术构建了重金属铜和镉暴露铜锈环棱螺全组织均一化cDNA文库,文库库容为1.78×106克隆,重组率大于99%.从初始文库中随机挑取6000个克隆进行测序,获得5 473个高质量表达序列标签(ESTs)序列.经聚类分析得到3 961个Unigene(平均长...     

重组钝顶节旋藻藻蓝蛋白基因在聚球藻中的表达

藻蓝蛋白(Phycocyanin)具有抗氧化、消炎、抗癌、增强免疫等生理活性和荧光特性.本研究从钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)中克隆藻蓝蛋白基因,构建重组藻蓝蛋白并在聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC 7942)中表达.利用PCR技术克隆钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基(cpc A)与β亚基(cpc B)基因,在cpc A的5’端及3’端加入编码6×His标签基因,克隆Hiscpc A基因,并构建同源重组表达载体p U BCA3D-1.通过自然转化法将p UBCA3D-1转入聚球藻中,经筛选鉴定获得了转基因藻株.PCR验证结果表明,目的基因整合到聚球藻基因组中的概率为86.6%.转基因聚球藻在无抗生素筛选条件下连续培养2个月,仍能稳定表达重组Cpc A.以上结果表明,重组钝顶节旋藻藻蓝蛋白在聚球藻中稳定表达;研究结果为节旋藻cpc A基因改造、重组Cpc A进一步分离纯化以及重组藻蓝蛋白的生产奠定了基础.     

麻疯树叶绿ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱胞和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列.对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1 368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量(Mr)大小为52.1×103.同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性.RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达.此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能.对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累.上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶.     

环境微生物中芳环加氧酶的获取策略

芳环加氧酶可催化芳香环的羟基化反应,广泛应用于生物修复及化工合成行业.本文在综述芳环加氧酶的分类和应用的基础上,详细探讨基于纯培养技术与宏基因组技术的芳环加氧酶开发策略,并首次对这些策略进行比较和评估.利用传统的纯培养技术已经获得大量的芳环加氧酶,然而这些加氧酶种类单一,重复率高,且新颖性不足.新兴的宏基因组技术赋予了开发未培养微生物资源的新思路,但利用其获取芳环加氧酶的研究刚刚起步,存在着筛选效率低、异源表达困难等难题.本文从基因信息量、筛选通量与效率、时间与成本以及目的基因下游表达可行性等方面对这两种方法进行综合评价,并提出宏基因组技术筛选不同类型芳环加氧酶的适用方法.纯培养技术与宏基因组技术的有机结合,与蓬勃发展的各种组学技术一起,将有助于推动芳环加氧酶的理论研究及生物催化产业的快速发展.     

L-山梨糖还原酶基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的酶学特性

为获得L 山梨糖还原酶 (SR)整个操纵子序列 ,以 pGEM 3zf( )作为载体构建了Gluconobactersp .S6基因文库 .结合转化子在以L 山梨糖为唯一碳源培养基上的生长情况 ,利用PCR技术筛选到一个含L 山梨糖还原酶基因的阳性克隆pGEM 3zf( ) sr3/E .coli,酶切鉴定插入片断长度约 5 .0kb左右 .以 pGEM 3zf( ) sr3/E .coli质粒DNA为模板 ,扩增SR结构基因 .PCR产物经测序验证为SR基因序列后 ,与表达载体Pet32a( )相连 ,转化宿主大肠杆菌AD4 94 (DE3)对SR基因进行表达 ,并利用重金属离子亲和层析技术对SR融合蛋白进行了纯化 ,对其酶学特性进行了研究 .结果表明 :还原型辅酶II(NADPH)是SR酶蛋白的最适电子供体 ;SR酶蛋白的最适反应pH为 7.0 ,pH为6 .5时保持稳定 ,酶活力较高 ;最适反应温度是 5 0℃ ,30℃时热稳定性较好 .SDS PAGE电泳分析 ,SR融合蛋白的Mr 在6 5× 10 3 左右 ,由此推测出天然SR的Mr 在 5 3× 10 3 左右 ,与SR基因序列推测出的分子量大小一致 .图 13表 2参 6     

功能宏基因组学在新型抗生素耐药基因研究中的应用进展

抗生素耐药性是二十一世纪人类面对的最严峻的环境健康问题之一.抗生素耐药基因(Antibiotics resistance genes, ARGs)被认为是一类新型环境污染物.当前针对ARGs的主要研究方法有细菌分离和培养法、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、和宏基因组法.然而,仅有功能宏基因组方法能发现新型的ARGs.功能宏基因组方法利用新一代测序技术的高通量的特性,结合分子生物学技术和功能筛选构建有关抗生素耐药性的基因库,通过生物信息学分析高效地发现新型ARGs.本文综述了近来利用功能宏基因组技术筛选新型ARGs的相关研究进展,总结了功能宏基因学相关的技术和方法的优势和限制,并展望了功能宏基因学方法进一步发展的方向.     

腺苷酸环化酶抑制剂体外筛选模型的建立及应用

腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)通过调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine cyclophosphate,cAMP)的合成从而调控细胞相关功能.在卵巢中,cAMP调控卵母细胞的发育及卵子的成熟,cAMP含量变化影响下游芳香化酶的表达,进而影响雌激素的生物合成.为开发靶向AC的候选药物,根据AC1、AC2两个活性区域,利用大肠杆菌系统克隆表达可溶ⅠC1-ⅡC2重组融合蛋白,使用ATP检测试剂盒,检测ⅠC1-ⅡC2的催化活性,从而建立有效的ⅠC1-ⅡC2蛋白体外筛选抑制剂模型.利用该模型筛选了由2 861个化合物组成的文库.化合物来那替尼(neratinib)可明显抑制ⅠC1-ⅡC2蛋白活性,且呈浓度依赖性,其IC50为10.2±0.152 2μmol/L.进一步研究发现,来那替尼可显著降低人卵巢颗粒细胞KGN细胞中芳香化酶的表达,并且抑制雌激素的生物合成.本研究通过建立蛋白体外筛选模型发现来那替尼具有抑制AC的活性,结果可为开发新的靶向芳香化酶治疗多囊卵巢综合征等疾病的候选药物提供参考.(图5表1参28)     

焦化废水生物膜样品和苯酚降解菌分离株基因盒的分析

使用59-碱基(59be)保守序列和整合酶基因的引物进行PCR扩增,研究了焦化废水处理装置中微生物菌群的基因盒结构,并对两株分离的苯酚降解荫IS-17和IS-46的基因盒进行了扩增测序分析.从5个焦化废水生物膜总DNA样品中均获得了基因盒扩增产物.对IS-17和IS-46的基因盒PCR产物克隆建库并测序,通过序列比对等方法来研究和分析序列的功能.发现本研究获得的基因盒与已报道的基因盒存读码框序列、两端引物结合序列、间隔区大小等方面存在一些不同.本研究结果表明,在焦化废水生物膜菌群中普遍存在基因盒结构,采用基因盒PCR能够从环境或菌株中获取新基因.     

麦草畏降解菌株Sphingobium sp.Dca-5的分离、鉴定及降解特性

麦草畏是一种广谱高效除草剂,随着抗麦草畏转基因作物的推广和使用,麦草畏的使用量急剧增加.为研究麦草畏的微生物降解机制,发掘新的麦草畏高效降解菌株和基因资源,从农药厂排污口土壤中筛选到一株以麦草畏为唯一碳源生长的鞘酯菌属(Sphingobium sp.)细菌Dca-5.该菌株48 h内完全矿化2.0 mmol/L的麦草畏,并检测到代谢产物3,6-二氯水杨酸,表明该菌株通过脱甲基起始麦草畏降解.Dca-5粗酶液在添加NADH时具有麦草畏脱甲基酶活性,但加入细胞色素P450抑制剂1-氨基苯并三唑、增效醚或马拉硫磷后酶活受到显著抑制.在Dca-5基因组中找到两个3,6-二氯水杨酸降解基因簇但未发现DMO和dmt同源基因.结果表明菌株Dca-5中的麦草畏脱甲基酶是一个新的细胞色素P450类单加氧酶.本研究为阐明麦草畏的微生物降解代谢机制,获得新的麦草畏脱甲基酶基因提供了菌株材料和理论依据;并且Sphingobium sp. Dca-5能快速矿化麦草畏,在麦草畏污染土壤的微生物修复方面具有良好的应用前景.(图8表1参27)