苏云金芽胞杆菌菌株WB9编码活性因子的基因分析

采用PCR—RFLP及PCR技术对苏云金芽胞杆菌新分离菌株WB9的ICP、VIP、几丁质酶和肠毒素4种活性因子的编码基因进行了分析．结果表明，该菌株含有编码ICP的cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和cry1GaS个cry1基因型，编码Vip3A蛋白的vip3A基因以及编码3种肠毒素的hblA、bceT和entS基因；不含编码几丁质酶的基因．将vip3A、hblA、bceT和entS基因PCR产物回收纯化后直接测序，经在线的BLAST软件进行同源性分析，前两个基因片段与Bt已公布基因序列的相应片段同源性分别为99％和96％～98％，bceT基因片段与蜡质芽孢杆菌bceT相应片段同源性为97％．     

邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)基因的定位、克隆和表达

射性同位素标记ｔｆｄＣ基因片段作探针,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交定位Ｌ１菌株的邻苯二酚１,２双加氧酶基因位于ＰｓｔⅠ的Ｉ片段和ＢａｍＨⅠ的Ｍ和Ｎ片段．低熔点琼脂糖回收ＰｓｔⅠ的Ｉ段,直接克隆至表达载体ｐＫＴ２３０上,获得重组子ｐＫＴ２３０ｐ．重组子转化不具开环酶活性的甲胺磷降解菌Ｐ２,获得高效的Ｃ１２Ｏ酶活     

稀有鮈鲫成体神经发生相关基因的分子克隆及序列分析

成体神经发生是脊椎动物中广泛存在的一种生物学特征。成体硬骨鱼类的脑展现出强烈的神经活性以及出色的脑修复能力,这使得硬骨鱼类成为研究成体神经发生和脑修复的一个理想的模型。本文克隆了成体稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)脑组织中神经发生及脑修复相关的hes5、pax6、sox11和prox1基因的部分c DNA序列并进行了序列分析。序列分析结果表明,pax6和sox11基因片段与斑马鱼(Danio rerio)对应的基因片段的同源性最高,分别为97%和94%;hes5基因与鲤鱼(Cyprinus carpio)相对应的基因片段的同源性最高,为92%;prox1基因在物种间的同源性最低。基于稀有鮈鲫和已知物种相应基因的核苷酸序列构建了系统发育树,发现稀有鮈鲫prox1基因与其他硬骨鱼类的亲缘关系最远。本文为进一步开展神经毒性类化学品对水生生物鱼类的成体神经毒性作用机制研究提供了分子生物学基础。     

EoNPV的限制性酶切图谱及polyhedrin基因和egt基因的定位

用８种限制性内切酶酶解茶尺蠖Ｅｃｔｒｏｐｉｓｏｂｌｉｑｕａ核型多角体病毒（ＥｏＮＰＶ）基因组ＤＮＡ,获得大于０．８８ｋｂ的片段数分别为７、３８、１９、１７、１６、９、３２和１４．由此统计,基因组平均大小大于１１８．５ｋｂ,即Ｍｒ约大于７８．６×１０６．用ＢｍＮＰＶ的多角体蛋白（ｐｈ）基因和ＡｃＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因为探针,应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法,将ＥｏＮＰＶ的ｐｈ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩＤ、ＥｃｏＲＩＭ、ＥｃｏＲＶＬ、ＨｉｎｄⅢＦ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＨ和ＸｈｏＩＢ片段上,将ｅｇｔ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩｌ、ＥｃｏＲＩＫ、ＥｃｏＲＶＡ、ＨｉｎｄⅢＨ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＢ、ＸｈｏＩＩ片段上．通过克隆和酶切鉴定ＥｃｏＲＩＭ和ＥｃｏＲＶＬ片段,测定ｐｈ基因部分序列,并以ＥｃｏＲＩＭ为探针对基因组酶切印迹进行杂交,制作了ＥｏＮＰＶｐｈ基因和ｅｇｔ基因区的酶切图谱,推定ｅｇｔ基因保守区位于ｐｈ基因上游约４．５５ｋｂ处．     

干扰烟草GA 20-氧化酶siRNA植物表达载体的构建及矮化烟草的产生

根据烟草(Nicotiana tabacum)GA 20-氧化酶基因序列,设计2对分别含有特定酶切位点的特异引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增目的基因(约250 bp)片段.将正、反向目的片段分别插入中间载体的内含子两侧.再经BamH I和Sac I双酶切回收约700 bp的目的片段,插入到双元载体质粒p2355中,成功构建了含GA 20-氧化酶基因片段的反向重复序列植物表达载体p23700,其转录产物能形成发夹RNA(hpRNA),产生小分子干扰RNA,干扰目的基因的表达.将p23700质粒导入根癌农杆菌EHA105中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得表型矮化的转基因烟草.图4参14     

用简并引物扩增与克隆D.radiodurans超氧化物歧化酶和过氧化氢酶基因片段

依据超氧化物歧化酶（ＳＯＤ） 和过氧化氢酶（Ｃａｔ） 的保守性氨基酸序列,设计简并引物,自Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ 基因组ＤＮＡ扩增并克隆了ＳＯＤ和Ｃａｔ 基因片段．ＳＯＤ 和Ｃａｔ 基因片段分别长４５３ ｂｐ 和６７３ ｂｐ,各编码１５１和２２４ 个氨基酸,氨基酸序列与不同生物来源的ＳＯＤ或Ｃａｔ 具有高度同源性     

扑草净降解菌降解特性、降解基因保守序列的扩增及同源性分析

从受污染农田中分离到一株补草净降解菌FR，经鉴定属于假单胞菌，考察了温度及pH对其降解能力的影响，确定pH7.0,32℃为最适作用条件；设计引物，通过PCR扩增到一条长度约为500bp的降解基因保守片段，通过对该片段部分序列测定及同源性搜索，证实该片段与atzA,triA等均三嗪化合物水解酶基因具有很高的同源性。     

两种龟类Sox基因的PCR扩增及SSCP分析的研究

采用ＰＣＲ技术,扩增了平胸龟、黄缘盒龟的Ｓｏｘ基因,扩增产物与人ｐＹ５３．３ＳＲＹ基因探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了扩增产物是人ＳＲＹ基因的同源片段;采用ＳＣＰ分析技术,显示龟类该基因片段的序列与人有较大差异,而龟类种间差异则较小,种内雌雄个体间则无差异．本文结果支持Ｓｏｘ基因在系统演化上十分保守的结论．     

长链烷烃降解菌alkB片段的分离和鉴定

分离并鉴定了长链烷烃降解菌Pseudomonasaeruginosa1785和P.marginata766烃羟化酶基因alkB片段.根据烃羟化酶的保守氨基酸序列,设计兼并引物,扩增P.aeruginosa1785和P.marginata766的alkB片段,获得了目标产物.经DNA测序和氨基酸序列分析,证实目标片段编码的肽段含有烃羟化酶的特征基序.由此确认采用该方法分离到了长链烷烃降解基因的alkB同源体片段.DNA序列比对结果表明,P.aeruginosa1785和P.marginata766的alkB片段与P.aeruginosaPAO1的alkB1和alkB2的相似性分别达到95.7%和94.8%.这些alkB片段可用于分析烃降解微生物群落结构.图3表2参11     

水稻精细胞优势表达基因RSSG58的启动子克隆和功能鉴定

利用本实验室已经克隆的水稻精细胞优势表达基因RSSG58的cDNA序列与NCBI中的粳稻基因组文库进行比对、定位,结合生物信息学方法分析预测基因上游的启动子序列.在此基础上设计引物,以粳稻Oryzasativa(japonicacultivar-group)日本晴黄化苗总DNA为模板,采用DNA聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增出基因上游1093bp和462bp两个不同长度的启动子缺失片段(分别命名为JP58B和JP58S),测序结果显示,其具有大多数高等植物启动子的保守元件.进一步构建启动子片段的植物表达载体pBI121-JP58B和pBI121-JP58S,瞬时表达结果显示,两个启动子片段对报告基因GUS均具有启动活性.图4参20     

Bt肠毒素基因与plcR基因的相关性及肠毒素对小鼠的急性毒性

用PCR方法检测溶血肠毒素BL、肠毒素T和肠毒素S三种肠毒素基因(hblA、becT、entS)及毒素调控基因plcR在30株苏云金芽胞杆菌株(Bt)中的分布.结果表明,含有hblA基因、entS基因、becT基因及plcR基因片段的Bt菌株分别占66.7%、70%、70%和73.3%.其中,含有plcR基因的菌株都至少含有一种肠毒素基因,不含肠毒素基因的菌株也未检测到plcR基因,说明plcR基因与肠毒素基因有着密切的关系.用3个Bt菌株WB9、HD2和HD9(都含有hblA、becT、entS和plcR基因片段,HD2和HD9经RPLA与TECRA肠毒素检测试剂盒检测具有高滴度)对小白鼠进行口服急性毒性试验.结果表明,所有3种供试菌株的发酵上清液对小白鼠行为和健康没有明显影响,对内部器官(心、肝、肺等)也没有产生病理现象.图5表3参14     

环境胁迫和乙烯对番茄PR-NP24基因表达的影响

根据已报道的番茄PR-NP24基因序列设计引物,经PCR克隆出长为477bp的番茄PR-NP24基因片段,以该片段制备探针,采用Northern杂交技术对该基因在番茄(WT)和乙烯反应突变体番茄(Nr,rin,T4B-11)中的表达进行了研究.杂交结果表明,该基因主要在果实和根部表达,伤害抑制WT、Nr番茄叶片中该基因的表达,而对rin番茄叶片无明显影响;干旱、淹水等环境胁迫和乙烯均能不同程度地诱导其表达,而在不同温度下,PR-NP24基因表达变化不大.图7参13     

紫杉醇合成代谢途径中苯丙基转移酶cDNA的克隆

从南方红豆杉(Taxus chinensis var．mairei)愈伤组织中直接提取出总RNA．采用RT—PCR技术获得苯丙基转移酶基因cDNA片段，将该片段克隆在载体pGEM—T Easy Vector上并转化到大肠杆菌DH5α中，经Spe I／Xho I双酶切检测及cDNA全长序列分析，证实该片段确为苯丙基转移酶基因，与已报道的从东北红豆杉(Taxus cuspidata)中得到的苯丙基转移酶基因序列具很高的同源性．图5参6     

大熊猫与熊类动物性别的分子鉴定

根据已知动物的性别决定因子基因序列设计引物,以非性别特异性的脑源性神经营养因子基因片段（ＢＤＮＦ）作为正对照,用于扩增大熊猫、浣熊、天山棕熊和马来熊个体的ＳＲＹ（ｓｅｘｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｎＹｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）基因片段并对其进行凝胶电泳分析,由此建立了一套简单、快速、可靠的动物性别分子鉴定方法．该方法不仅有利于尽快确定大熊猫等珍稀濒危动物的性别,而且也可以用于野外种群的性别比例调查．     

绿萍LmPDS基因RNAi载体的构建及遗传转化

PDS基因编码控制类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶,其被沉默或抑制性表达会使叶片组织出现斑驳、黄化、白化的现象.构建绿萍(Lemna minor)LmPDS基因RNAi载体及完成遗传转化研究,对于实现RNAi技术在绿萍中的应用具有重要意义.选取595 bp LmPDS基因片段为干涉片段,利用中间载体pUCCRNAi将克隆的LmPDS干涉片段正反向插入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCST中.将成功构建的RNAi载体通过农杆菌介导法转入绿萍愈伤,经愈伤抗性筛选、植株再生、植株扩培、标记基因NPTII检测等过程,获得植株70株,其中4株为转基因阳性植株.再经荧光定量PCR分析、番茄红素含量检测、表型观察转基因植株.结果显示,转基因阳性植株LmPDS相对表达量明显下降,为对照的28.8%-40.5%,其番茄红素含量也明显下降,且叶片出现了明显的白化表型.本研究成功构建绿萍LmPDS基因RNAi载体,实现了RNAi在绿萍中的应用,结果可为进一步的绿萍基因功能研究提供材料和方法.(图11表1参30)     

硫酸粘菌素对土壤反硝化细菌nirS、nosZ基因多样性的影响

建立室内的土壤硫酸粘菌素暴露胁迫模型,采用末端限制性片段长度多态性分析(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)技术分析不同浓度硫酸粘菌素残留对土壤反硝化细菌的影响。结果表明,每个处理组nirS、nosZ基因的分类操作单元(Operational Taxonomic Units,OTU)总数均比对照组低,且nirS基因呈现剂量依赖效应;各组优势细菌nirS基因主要集中在10个片段中,nosZ基因主要集中在18个片段中,nirS基因较nosZ基因丰度变化大;多样性指数分析表明,nirS基因Shannon指数在7 d时,高浓度组较对照组差异显著(P0.05); Simpson指数在各浓度处理组较对照组差异均显著(P0.05); Pielou指数在7 d、49 d时,高浓度处理组与对照组差异显著(P0.05); nosZ基因Shannon指数在35 d时,中浓度组与对照组差异显著(P0.05); 49 d时,低浓度组与对照组差异显著(P0.05); Simpson指数在21 d、35 d时,低浓度组与对照组差异显著(P0.05); Pielou指数在各处理组之间差异均不显著(P0.05)。当药物含量≥5 mg·kg~(-1)时,反硝化细菌的均匀度、群落多样性降低,优势度升高,群落结构特征均发生改变,其中对nirS基因影响显著。nirS基因更适合作为硫酸粘菌素污染的指示基因。     

乳酸杆菌食品级表达系统的构建与鉴定

以LacF为选择标记,构建了乳杆菌食品级表达系统.首先克隆了Latobacillus caseiATCC393乳糖操作子LacF和LacG基因片段,将LacF克隆至载体pRV300上后,利用T4DNA聚合酶消除了LacF片段的SphI位点,构建LacF基因编码区移码突变的质粒pRV△lacf随后将LacG片段与质粒pRV△lacf接后获得了质粒pRvg△lacf.同时将没有移码突变的LacF和LacG基因片段克隆至载体pRV300上,构建了整合型载体pRVgf.将质粒pRVg△lacf电导入L.casei ATCC393中,筛选到不能在乳糖平板上生长的突变菌株.经PcR分析表明,该菌株的LacF基因被移码突变基因Lac△F取代,命名为L.casei MBL25(LacF).为了鉴定此系统的可行性,将豆豉溶栓酶基因成熟肽编码片段插入到整合型载体pRVgf中,成功构建了质粒pRVgf-badfe,将其导L.casei MBL25(LacP)后,筛选LacF 菌株.PcR分析结果显示,豆豉溶栓酶基因已经整合到L.casei染色体巾并且表型已经得到恢复.表明MBL25(LacF-)中LacF基因的功能能被pRVgf-bafe上的LacF基因互补.经0.5%乳糖过夜诱导后,SDS-PAGE电泳显示成功表达了相对分子质量(M)28x103大小的特异蛋白.图3参22     

变性高效液相色谱在大通量筛查基因突变中的应用

应用变性高效液相色谱(DHPLC)对已知序列的含外显子7的斑马鱼p53基因片段PCR产物进行突变检测,结果表明,通过克隆测序方法检测出的点突变,用DHPLC同样可以检出.且对该片段的最优化检测柱温为60℃,其特异性很好,敏感性大于95%.     

CMS高粱保持系叶绿体基因ps1A1和ps1A2片段的克隆与序列比对

以15种包括同质异核和同核异质高粱材料的总：DNA为模板进行RAPD分析，196个随机引物中，引物Y-19扩增得到一个很有规律的差异片段SAY-192300。该片段只出现在4个保持系(B)和3个恢复系(R)中，而不出现在6个不育系(A)和2个杂种F1中，进一步对cms—Al、cms—A2两套8个材料(A／B／R／F1)的总DNA、mtDNA和cpDNA用引物Y-19进行扩增，发现片段SAY-192300仅在cpDNA得到，Southern杂交结果证实了片段SAY-192300的叶绿体来源，同时也表明在cms胞质中该片段所在区未发生插入、缺失等大的结构变异,DNA序列测定结果表明，该片段为叶绿体ps1A1和ps1A2基因的部分序列。图6表2参19。