RNAi技术及其在植物中的应用研究进展

RNA干扰（RNA inteffemnce，RNAi）是由双链（double-stranded RNA，dsRNn）所引起的序列特异性基因沉默。是真核生物中一种非常保守的机制．RNA干扰依赖于小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）与靶mRBA之间的严格碱基配对，具有高度特异性．本文就RNM的发现、作用机制研究、特点、以及在植物功能基因分析、抗病毒与品种改良等方面的应用进行了综述，并对存在的问题和应用前景作了分析和预测．     

具双T-DNA区的大麦黄矮病毒复制酶基因RNAi植物表达载体的构建(英文)

RNAi系双链RNA诱导同源mRNA降解,导致特定基因表达沉默的一种现象.RNAi技术是通过基因工程防治植物病毒病的最佳途径.由大麦黄矮病毒(Barely yellow dwarfvirus,简称BYDV)引起的禾谷类黄矮病发病面积和危害程度在我国呈加重趋势.BYDV-GAV是当前流行的大麦黄矮病毒株系,本文针对BYDV-GAV复制酶基因序列,构建能在细胞内转录形成发卡RNA双链结构的表达盒,并将其置于中间载体pVec8-2b的T-DNA区,pVec8-2b的另一T-DNA区含有hpt选择报告基因表达盒.具双T-DNA区的病毒复制酶基因发卡RNA高效表达载体已导入根癌农杆菌,可用于诱导植物RNAi,创制无选择标记基因的抗大麦黄矮病转基因作物.     

绿萍LmPDS基因RNAi载体的构建及遗传转化

PDS基因编码控制类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶,其被沉默或抑制性表达会使叶片组织出现斑驳、黄化、白化的现象.构建绿萍(Lemna minor)LmPDS基因RNAi载体及完成遗传转化研究,对于实现RNAi技术在绿萍中的应用具有重要意义.选取595 bp LmPDS基因片段为干涉片段,利用中间载体pUCCRNAi将克隆的LmPDS干涉片段正反向插入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCST中.将成功构建的RNAi载体通过农杆菌介导法转入绿萍愈伤,经愈伤抗性筛选、植株再生、植株扩培、标记基因NPTII检测等过程,获得植株70株,其中4株为转基因阳性植株.再经荧光定量PCR分析、番茄红素含量检测、表型观察转基因植株.结果显示,转基因阳性植株LmPDS相对表达量明显下降,为对照的28.8%-40.5%,其番茄红素含量也明显下降,且叶片出现了明显的白化表型.本研究成功构建绿萍LmPDS基因RNAi载体,实现了RNAi在绿萍中的应用,结果可为进一步的绿萍基因功能研究提供材料和方法.(图11表1参30)     

HvABA8′OH-1基因RNAi载体的构建及遗传转化

穗发芽严重影响作物的产量和品质,种子休眠性弱是穗发芽形成的主要原因之一.ABA是维持胚休眠抑制萌发的重要激素,大麦HvABA8′OH-1基因编码控制内源ABA主要分解代谢途径的关键酶.以双元载体pGreenⅡ为骨架载体,分别选取HvABA8′OH-1的保守区序列(293bp)和特异区序列(474bp),水稻胚乳特异性启动子pGlub,成功构建了种子特异性RNA干扰表达载体pOHC和pOHS.利用农杆菌介导法将载体转入水稻,获得植株50株.经鉴定,其中18株为转基因阳性植株.研究结果为进一步分析HvABA8′OH-1基因的生物学功能,以及通过基因工程途径建立作物抗穗发芽育种新方法提供了理论依据和材料.     

番茄SIZ1-like1基因的克隆与功能

SUMO(Small ubiquitin-related modifi er)化修饰是植物体内一种重要的蛋白质功能调节方式.它调控植物细胞中蛋白的降解与定位,植物抗性及激素调节等.SIZ1是SUMO的E3连接酶并在SUMO化中起重要作用.为了解SIZ1基因在番茄中的功能,成功克隆番茄(Solanum lycopersicum)SIZ1基因(SIZ1-like1)并构建番茄SIZ1-like1RNA干涉和过表达载体后,通过农杆菌介导转入野生型番茄,成功获得6个独立的转基因阳性植株.荧光定量PCR(Real-time PCR)分析野生型番茄中SIZ1-like1基因的组织表达特异性,发现SIZ1-like1在植物的各个组织中都有表达.构建SIZ1-like1黄色荧光蛋白融合表达载体,通过对SIZ1-like1融合黄色荧光蛋白转基因番茄的根尖进行荧光显微观察,证实番茄SIZ1蛋白定位于细胞核.干旱胁迫实验分析显示,过表达转基因植株抗旱性强于野生型,且脯氨酸含量是野生型的3倍左右,而RNAi植株抗旱能力则较弱.因此SIZ1基因对番茄抗旱起到了正调控作用.     

核糖体RNA基因在海洋动物分子系统学中的应用

随着分子遗传标记在分子系统学中应用的发展,核糖体RNA基因因其特殊的组成结构和演化方式被广泛应用于海洋动物分子系统学研究中.本文系统地介绍了真核生物核糖体RNA基因的组成和性质及其近年来在海洋动物系统进化、分类和种质鉴定、遗传多样性研究等方面研究中的应用.从中可以看出,核糖体RNA基因已经广泛应用于海洋动物的分子系统学研究中,但主要利用的是核糖体RNA基因的一级结构.图2参36     

番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

番茄微管结合蛋白EB1调控盐胁迫应答

微管结构的动态受微管结合蛋白(Microtubule-associated proteins,MAPs)调控,在植物的生长发育和环境信号响应中有重要作用. EB1(End-binding protein 1)是微管正末端特异结合的MAP,蛋白同源序列比对搜索显示番茄基因组有2个EB1基因,SlEB1a(Solyc03g116370)和SlEB1b(Solyc02g092950).构建SlEB1a基因的过表达番茄植株和同时干涉SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi番茄植株,并分析它们对微管解聚药物戊炔草胺和盐胁迫的敏感性.结果证明番茄微管结合蛋白EB1(SlEB1)在盐胁迫应答中有重要作用.与野生型番茄植株相比,过表达番茄植株对1μmol/L微管解聚药物戊炔草胺更加敏感,而RNAi植株对1μmol/L戊炔草胺更加耐受,与此相反,过表达番茄植株对100 mmol/L NaCl更加耐受而RNAi番茄植株对100 mmol/L NaCl更加敏感.因此,SlEB1可能通过负调控番茄周质微管的稳定性而正调控番茄对盐胁迫的应答;本研究结果可为进一步研究植物周质微管动态在盐胁迫应答中的作用机制奠定基础.     

马铃薯X病毒山西分离物外壳蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

对GenBank公布的马铃薯X病毒的基因组核苷酸序列和外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了同源性比对分析.结果表明,马铃薯X病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的同源性要高于基因组全序列的同源性,并且外壳蛋白基因3'端核苷酸序列的同源性又高于5'端.设计一对特异性引物,以马铃薯感病植株的总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到了马铃薯X病毒外壳蛋白基因.该基因含714个核苷酸,编码238个氨基酸.核苷酸序列比对结果表明,该基因与Genbank公布的马铃薯X病毒其他分离物的外壳蛋白基因的同源性为80.2%～97.5%,且3'端的同源性要高于5'端.上述结果预示,RNA干扰抗病毒基因工程中,利用马铃薯X病毒外壳蛋白基因的3'端比用5'端是更好的策略.     

基于RNA干扰的家蝇几丁质酶2的幼虫转录组测序

几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类,在昆虫整个生长发育过程中发挥着重要作用.为筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,根据家蝇几丁质酶2(Musca domestica chitinase 2,MdCht2)基因序列设计并合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),采用微量注射法向家蝇2龄幼虫导入dsRNA,对对照组及干扰组的样本进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行GO(gene ontology)功能注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析.结果显示,注射dsRNA 24 h后,幼虫MdCht2 mRNA的表达显著下降,提示导入的dsRNA干扰了MdCht2的表达.经转录组测序,与对照组相比,显著差异基因共213条,其中78条基因为上调表达,135条基因为下调表达.随机选取8条显著差异基因通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证,该结果与转录组结果趋势一致.根据功能注释发现这些差异基因与生长发育、脂类代谢、免疫调控等途径相关.本研究通过RNA干扰和转录组测序技术处理家蝇获得大量差异基因,结果可为后续几丁质酶相关基因的挖掘和鉴定及功能研究提供一定的数据基础.(图7表4参46)     

烟草花叶病毒siRNA设计及其植物表达载体构建

RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单链DNA复性后插入到p2355上,经PCR、测序验证,表明已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体.图3表1参26     

冠状病毒的siRNA设计

用自己编写的siRNA查找设计的程序sRNAFinder，对来自GenBank的7个冠状病毒全基因组序列进行了siRNA的查找，并分析了各自的分布情况。结果表明，ORF1ab、S、E、M和N这5个主要基因中，候选siRNA占全基因组中所有候选siRNA的比例达到90％以上，根据基因组结构特征，对SAILS—CoV进行的siRNA分布分析表明，在全部449个候选siRNA中，有443个分布于orf1ab中，与基于RNAi原理的抗病毒药物设计思想相吻合。表8参15。     

水稻DDB1基因的表达特性及功能分析

利用RNA干涉技术构建水稻DDB1(Damaged DNA binding protein 1)基因不同启动子驱动植物表达载体,DDB1-RNAi和DDB1-glu-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入水稻愈伤,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,与野生型植株相比,两组转基因植株幼叶内DDB1的表达量...     

水稻锌指蛋白基因OsWIP6的克隆、表达及RNAi载体转化

为了解水稻C2H2型锌指蛋白转录因子基因的表达调控机理及生物学功能,克隆了水稻的一个C2H2型锌指蛋白转录因子基因(OsWIP6),并构建其RNA干涉植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株.生物信息学分析显示,OsWIP6氨基酸序列与拟南芥两个WIP家族转录因子高度同源.组织差异性表达分析表明,该基因在水稻花发育上具有表达偏向性.与野生型相比,转基因水稻表现为抽穗延迟,结实率及千粒重降低,半定量分析显示转基因植株OsWIP6表达量明显下降.因此,推断OsWIP6基因与水稻育性密切相关.     

番茄HP1和HP2基因RNA共干涉载体的构建及遗传转化

番茄HP1和HP2是色素积累的负调控因子,在光形态建成和色素积累调控中起着重要作用.将番茄HP1、HP2基因片段导入到植物表达载体pBI121,用番茄果实特异表达的TMF7基因的启动子替换原有的CaMV 35S启动子,构建果实特异表达HP1、HP2双基因RNA共干涉植物表达载体pBI121-TMF7-HP1HP2.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株果实内HP1、HP2的表达量均明显低于野生型植株果实.转基因植株果实叶绿素含量比野生型明显升高,而叶片中的叶绿素含量无明显差异.该研究结果为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路.图6表2参15     

丝状真菌基因功能研究的方法

近年来不少丝状真菌全基因组测序已完成或正在进行,基因功能研究成为真菌研究的一个热点.多种基因功能研究方法都已应用到丝状真菌领域,为丝状真菌的基因功能研究提供了许多不同的技术策略.本文总结了目前丝状真菌基因功能研究中常用的方法,如转座子标签法、基因敲除技术、RNA干扰、超表达及酵母杂交系统等,并对各方法在丝状真菌研究中的优缺点进行了阐述.参42