“活性甲醛”与甲醛远距离毒性的初步研究

甲醛是否具备远距离毒性(distant-site toxicity)是揭示甲醛与白血病关系的关键问题.本研究采用DPC、MTT实验方法检测甲醛的远距离毒性,结果发现当把等剂量的甲醛与GSH联合作用对细胞进行染毒后细胞内产生的DPC系数比单独同剂量的甲醛组要高很多,在MTT实验中发现在单独甲醛组中加入等量的GSH后细胞活性也出现了显著下降;在动物实验中,当对小鼠肝染毒后脑组织中也同样出现了损伤.说明甲醛在机体内与GSH形成了结合物,这种结合物可能协助甲醛完成跨膜并进入到局部组织再次释放出游离态甲醛,实现了甲醛的远距离毒性,这种结合态的甲醛称之为"活性甲醛".     

盐藻LHCB3蛋白的表达纯化及抗体制备

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)主要光捕获蛋白LHCB蛋白的功能,将已获得的盐藻Lhcb3基因构建到原核表达载体pET32a-DsLhcb3,通过优化表达条件,建立了高效的重组系统.pET32a-DsLhcb3在大肠杆菌中的优化表达条件为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h.采用镍离子亲合层析纯化获得LHCB3蛋白,并以此为抗原制备了多克隆抗体,经琼脂糖扩散检测效价,在1:16处有明显沉淀.提取盐藻总蛋白,经过制备的LHCB3抗体杂交,在29 000处获得两条明显的杂交条带,为进一步研究盐藻LHCⅡ蛋白表达机理奠定了基础.     

黑曲霉耐热木聚糖酶XYNB在毕赤酵母中的高效表达

高比活木聚糖酶的高效表达是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低生产成本的有效途径.将黑曲霉木聚糖酶基因XynB(不含信号肽)克隆到分泌型表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,G418和PCR鉴定的阳性转化子经0.5%甲醇、在28℃诱导表达.SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为20×103左右.优化的诱导表达条件为,每隔12 h添加0.5%的甲醇,发酵5 d后,比活达4 757 U/mg;其最适温度为55℃,最适pH为5.0,80℃处理30min后仍有74%的残余酶活.     

油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)与细菌间的基因水平转移

油菜菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）是油菜生产上最重要的病害之一,其致病性可能来源于基因水平转移（Horizontal gene transfer,HGT）.为认识其致病原理和寻找新的真菌抑制剂的靶点,首先通过BLASTp发现其基因XM₀01585458.1编码蛋白XP₀01585508.1与细菌比对结果中出现低E值3.23e-109和高SCORE值436,暗示存在HGT现象;进一步通过系统进化树的建立,发现该蛋白在进化分枝上更接近于细菌中由Streptomyces sp.C的NZ_CM000832.1基因编码的蛋白ZP₀7291173;同时核苷酸组成分析也发现该基因与油菜菌核病菌基因组的碱基组成有较大差别,GC含量提高了14.95%.这些结果证明了XM₀01585458.1的确存在基因水平转移事件.结构分析和COG蛋白功能分类显示该HGT序列编码蛋白XP₀01585508.1具有FA58C₃（Coagulation factors 5/8 type C domain）、Kelch repeat type 1、Galactose-binding domain-like、Galactose oxidase/kelch,beta-propeller等保守结构域,应为一个膜蛋白并参与多糖代谢,推测该水平转移基因与S.sclerotiorum在侵染植物时进行细胞壁水解和致病性有关.     

茄科雷尔氏菌蛋白质相互作用网络预测及分析

细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种世界范围的细菌性土传病害.该细菌基因组序列的完全测序,使得从蛋白质组角度来分析其蛋白质相互作用网络成为可能.本文通过朴素贝叶斯模型整合系统发生谱法、基因邻近法、基因融合法、操纵子法、同源映射法、微阵列法、域相互作用法等7种方法,并根据约豋指数确定的阙值,预测了可信的茄科雷尔氏菌的蛋白质相互作用网络.对网络中的分泌子网络和信号转导进行了分析,提出可能的药物作用靶点(cyaB、pilD、Fli、Rsp1526、VsrA、VsrB、PilH).对于未注释的蛋白依据蛋白相互作用推测了部分蛋白质的功能.本文也提供了完全免费的在线数据库支持,提供了方便的茄科雷尔氏菌的蛋白相互作用的查询及相互作用数据和推测的蛋白质功能数据的查询和下载(http://www.scbmp.org.cn/rsoppi.php).     

根肿(Plasmodiophora brassicae)休眠孢子的纯化和超声波破碎方法研究

根肿(Plasmodiophora brassicae Woronin)是严重危害十字花科植物的世界性病害.采用蔗糖密度梯度离心和超声波处理方法从油菜染病根部组织分离和提纯根肿休眠孢子.众多因素可以影响提纯休眠孢子的纯度,为了得到更高纯度和均匀度的休眠孢子的优化方法,我们对一系列影响因素如超声波破碎功率、pH、孢子破碎浓度、处理时间和不同的水溶物质等进行了研究.在pH值5.5左右、添加0.5%的二甲基亚砜、孢子浓度约为7×108、345W功率下超声波处理10min条件下获得了最优数量和均匀度的孢子,杂菌数量减少了51%以上,杂菌种类减少超过75%.超声波处理50min后,孢子破碎率稳定地达到90%以上,除菌率达99%以上.用此方法能在较短时间内获得高纯度和高均匀度的休眠孢子,为休眠孢子的深入研究提供了资料.图4表3参10     

盐胁迫下Dslhcb3和cao基因的表达及类囊体磷酸化状态转化

LHCⅡ在在类囊体膜中除了进行光能的吸收和传递之外,在维持类囊体膜的结构,调节激发光能在两个光系统之间的分配,光保护以及对各种环境的适应等过程中都起着重要的作用.为揭示盐藻LHCB在盐胁迫下的作用机制,以盐生杜氏藻(Dunaliella salina为材料,应用实时PCR的方法和蛋白电泳技术,研究lhcb3和叶绿素a加氧酶cao基因在低盐胁迫下的表达变化,以及盐藻类囊体膜的磷酸化水平和磷酯酶的变化.结果表明,在低盐环境下,lhcb3和cao基因的表达活性都呈降低的总趋势,这可能是盐藻适应不浓度盐环境胁迫的不反应.类囊体膜蛋白磷酸化水平先是降低,之后有所升高.时,发现磷酸酯酶有着相的变化趋势,并在12 h时最高.由此认为低盐条件下,类囊体膜蛋白在前期磷酸化水平的降低与磷酸酯酶活性降低有关,但在12 h后磷酸化水平有所升高,可能是细胞内平衡调节的结果,即磷酸激酶活性增强的结果.     

深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)华2-1产油发酵培养条件优化

为开发微生物油脂资源,从富含油脂的土样中分离获得一株产油脂微生物——深黄伞形霉(Umbelopsisisabellina)华2-1,油脂含量达48.60%.采用单因素和正交实验方法,对深黄伞形霉华2-1的发酵培养条件进行优化研究.优化的培养条件为:葡萄糖100 g/L,酵母粉3 g/L,接种量为20%,初始pH值为5.0～6.0,MgSO4.7H2O和KH2PO4的添加浓度分别为0.5 g/L和2 g/L,培养温度为31℃,最佳发酵培养时间为168 h.华2-1在优化发酵条件下可获得菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别为45.86 g/L、24.47 g/L和59.53%,较优化前分别提高了21.48%、33.42%和22.49%.因此,深黄伞形霉华2-1作为微生物油脂生产的新资源具有广阔的应用前景.     

油菜根肿休眠孢子间接酶联免疫检测法的建立

根肿病是由专性寄生菌--芸苔根肿菌感染所引起的一种严重影响十字花科植物生长的植物病害.本文针对根肿病缺乏简便、快速检测方法的问题,制备油菜根肿休眠破碎孢子抗血清,确定抗血清及酶标抗血清最佳工作浓度,优化间接酶联免疫反应条件;优化的抗血清和酶标血清的工作浓度分别为1:2000和1:1000,孢子的饱和包被浓度为107个/mL.确定休眠孢子稀释液的最低检测浓度为10个/mL,建市快速检测油菜根肿菌的间接酶联免疫吸附测定法,该方法稳定、可靠,板间误差和板内误差均小于10.0%.与9种土壤分离得到的真菌和7种土壤常见菌黑曲霉、粉红粘帚霉、立枯丝核菌、产黄青霉、绿色木霉、枯草杆菌、脓杆菌进行特异性实验,其中一种未知菌M1交叉反应率>30%,其余在8.51%～24.88%之间,真菌的交叉反应率普遍高于细菌.对已知孢子浓度的土壤进行了检测,土壤样品休眠孢子浓度的最低检测限度为103个/g.     

盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶不同结构域蛋白的表达纯化及其抗体的制备与分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质.3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐生杜氏藻甘油合成途径中的关键酶.与已经报道的其它物种的GPDH基因不同,盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶(Ds.GPDH)基因具有两个独立的功能结构域,即丝氨酸磷酸化酶结构域(SGPP domain)和3-磷酸甘油脱氢酶结构域(GPD domain).本实验在已克隆的Ds.GPDH2基因的基础上,以含GPDH2全基因序列的T质粒载体(pMD18-T-GPDH2)为模板,PCR扩增分别得到两个单结构域片段(SGPP与GPD),以及双结构域片段(GPDH),构建了pET32a-SGPP、pET32a-GPD和pET32a-GPDH三种原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达.纯化蛋白制备抗原,制备出3个多克隆抗体.Western Blot和交叉反应分析显示通过重组蛋白制备的多克隆抗体具有很高的特异性.图7参16