高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及酶学、转酯特性

从自然环境中筛选水解酶活高且酶学、转酯特性优良的产脂肪酶菌株,对脂肪酶工业化发酵生产及生物柴油制备的研究具有重要意义.采用罗丹明B平板初筛和摇瓶发酵复筛法,从70份含油脂丰富的样品中筛选产脂肪酶酶活较高的菌株进行16S rRNA鉴定,研究其酶学性质;用大孔树脂固定酶,在无溶剂体系中催化橄榄油制备生物柴油,研究其转酯特性.结果筛选到一株高产脂肪酶的菌株WZ10-3,通过p-NPP法测得其初始酶活为78.68 U/mL,经16S rRNA鉴定属于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.),与B.stabilis同源性达到99%.该菌在发酵48 h时达到产酶高峰,所产脂肪酶的最适作用温度为50℃,最适作用pH为7.0,70℃下的半衰期可达1 h,pH为7-9时稳定性良好.以大孔树脂NKA-9和HPD600为载体制备的2种固定化脂肪酶,催化橄榄油生产生物柴油的转酯率均可达到97%.综合表明,菌株WZ10-3脂肪酶的初始水解酶活高于大多数野生脂肪酶,热稳定性好且转酯特性优良,有很好的后续研究价值.图7表3参25     

杂合抗菌肽LPCB在毕赤酵母中的表达条件优化

为获取能表达具有天然活性的杂合抗菌肽的重组酵母菌,确定其最佳表达条件,将构建好的重组酵母表达载体pPICZα-A-CecropinB(1～10)-Magainin2(1～12)(简称pPICZα-A-CBMA)和pPICZα-A-Lfcin-Pro-CecropinB(简称pPICZα-A-LPCB)经SacⅠ线性化处理,分别电转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,PCR扩增验证,甲醇诱导表达.采用抑菌圈法初步测定产物活性,优化杂合肽LPCB诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度、培养基pH等表达条件,传代检测其质粒稳定性.结果显示,基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-CBMA和P.pastoris X-33/pPICZα-A-LPCB成功构建.表达产物前者抑菌活性微弱,后者抑菌活性良好.杂合肽LPCB的最佳表达条件为:25℃,pH中性培养,每24 h添加0.5%(V/V,φ)甲醇,诱导表达72 h.重组酵母菌pPICZα-A-LPCB在培养超过100代后,未发生质粒丢失.     

一株高产油脂丝状真菌的形态学及rDNA-ITS2分子鉴定

从采集的土样中分离获得45株产油脂菌株,其中丝状真菌7-4的原始油脂含量最高,达到46.80%.分别采用传统形态学鉴定方法及rDNA-ITS2序列克隆进行鉴定.形态学鉴定的结果初步表明该真菌为卷枝毛霉(Mucorcircinelloides),采用rDNA-ITS2序列进行复核表明该菌与卷枝毛霉(M.circinelloides)同源性为98.00%,而与易脆毛霉(M.fragilis)同源性达到100.00%.从构建的系统进化树中可以看出,该菌与易脆毛霉共同构成一个分支,并与卷枝毛霉聚成一大枝.结合形态学鉴定的结果确定菌株7-4为易脆毛霉(M.fragilis).其脂肪酸组成与植物相似,以棕榈酸、亚油酸、油酸为主,不饱和脂肪酸含量达91.77%.     

一株高产灵菌红素粘质沙雷氏菌的分离鉴定及发酵条件优化

天然色素化合物灵菌红素具有抑制细菌、真菌、疟疾、藻类和肿瘤细胞等多种生物学活性;微生物发酵是生产灵菌红素的主要方法.从自然界植物根际土壤中分离得到一株产红色色素的菌株JWR.经形态和16S rDNA测序鉴定,菌株JWR为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens);用酸性甲醇溶液对发酵液萃取得到灵菌红素的粗提物,利用FT-IR和HPLC鉴定产物,证明该菌株所产红色色素为灵菌红素.通过单因素以及正交优化法对发酵培养基组分和发酵条件进行优化,确定发酵培养基配方为橄榄油1.5 mL/L、牛肉膏0.5 g/L、硫酸镁0.25 g/L,发酵条件为接种量2.5%(V/V)、温度28℃、转速220 r/min.优化后灵菌红素产量提高到6.011 g/L,相比优化前提高了2.845倍.本研究分离粘质沙雷氏菌并优化发酵条件,提高了灵菌红素产量,可为其工业化生产奠定基础.     

产油脂微藻的分离鉴定及培养条件优化

为促进自养高产油微藻的工业化应用,从青海多种生境中分离到34株产油微藻,以筛选获得产油脂最高的青3-2-2株为出发株,18S rRNA分析表明其与栅列藻属(Scenedesmus sp.)同源性达到99%以上,确定该株属于栅列藻属.研究氮源、培养时间、培养温度、初始pH值等培养条件对微藻生物量及油脂含量的影响,优化培养条件为:硝酸钠为氮源,以10%(V/V)接种量接种于普通SE培养基,培养温度为25℃,初始pH 7.0,培养周期为20 d,可以获得较高的油脂产率,比优化前的产率增加了近70%.     

盐藻LHCB3蛋白的表达纯化及抗体制备

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)主要光捕获蛋白LHCB蛋白的功能,将已获得的盐藻Lhcb3基因构建到原核表达载体pET32a-DsLhcb3,通过优化表达条件,建立了高效的重组系统.pET32a-DsLhcb3在大肠杆菌中的优化表达条件为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h.采用镍离子亲合层析纯化获得LHCB3蛋白,并以此为抗原制备了多克隆抗体,经琼脂糖扩散检测效价,在1:16处有明显沉淀.提取盐藻总蛋白,经过制备的LHCB3抗体杂交,在29 000处获得两条明显的杂交条带,为进一步研究盐藻LHCⅡ蛋白表达机理奠定了基础.     

黑曲霉耐热木聚糖酶XYNB在毕赤酵母中的高效表达

高比活木聚糖酶的高效表达是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低生产成本的有效途径.将黑曲霉木聚糖酶基因XynB(不含信号肽)克隆到分泌型表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,G418和PCR鉴定的阳性转化子经0.5%甲醇、在28℃诱导表达.SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为20×103左右.优化的诱导表达条件为,每隔12 h添加0.5%的甲醇,发酵5 d后,比活达4 757 U/mg;其最适温度为55℃,最适pH为5.0,80℃处理30min后仍有74%的残余酶活.     

油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)与细菌间的基因水平转移

油菜菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）是油菜生产上最重要的病害之一,其致病性可能来源于基因水平转移（Horizontal gene transfer,HGT）.为认识其致病原理和寻找新的真菌抑制剂的靶点,首先通过BLASTp发现其基因XM₀01585458.1编码蛋白XP₀01585508.1与细菌比对结果中出现低E值3.23e-109和高SCORE值436,暗示存在HGT现象;进一步通过系统进化树的建立,发现该蛋白在进化分枝上更接近于细菌中由Streptomyces sp.C的NZ_CM000832.1基因编码的蛋白ZP₀7291173;同时核苷酸组成分析也发现该基因与油菜菌核病菌基因组的碱基组成有较大差别,GC含量提高了14.95%.这些结果证明了XM₀01585458.1的确存在基因水平转移事件.结构分析和COG蛋白功能分类显示该HGT序列编码蛋白XP₀01585508.1具有FA58C₃（Coagulation factors 5/8 type C domain）、Kelch repeat type 1、Galactose-binding domain-like、Galactose oxidase/kelch,beta-propeller等保守结构域,应为一个膜蛋白并参与多糖代谢,推测该水平转移基因与S.sclerotiorum在侵染植物时进行细胞壁水解和致病性有关.     

茄科雷尔氏菌蛋白质相互作用网络预测及分析

细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种世界范围的细菌性土传病害.该细菌基因组序列的完全测序,使得从蛋白质组角度来分析其蛋白质相互作用网络成为可能.本文通过朴素贝叶斯模型整合系统发生谱法、基因邻近法、基因融合法、操纵子法、同源映射法、微阵列法、域相互作用法等7种方法,并根据约豋指数确定的阙值,预测了可信的茄科雷尔氏菌的蛋白质相互作用网络.对网络中的分泌子网络和信号转导进行了分析,提出可能的药物作用靶点(cyaB、pilD、Fli、Rsp1526、VsrA、VsrB、PilH).对于未注释的蛋白依据蛋白相互作用推测了部分蛋白质的功能.本文也提供了完全免费的在线数据库支持,提供了方便的茄科雷尔氏菌的蛋白相互作用的查询及相互作用数据和推测的蛋白质功能数据的查询和下载(http://www.scbmp.org.cn/rsoppi.php).     

盐胁迫下Dslhcb3和cao基因的表达及类囊体磷酸化状态转化

LHCⅡ在在类囊体膜中除了进行光能的吸收和传递之外,在维持类囊体膜的结构,调节激发光能在两个光系统之间的分配,光保护以及对各种环境的适应等过程中都起着重要的作用.为揭示盐藻LHCB在盐胁迫下的作用机制,以盐生杜氏藻(Dunaliella salina为材料,应用实时PCR的方法和蛋白电泳技术,研究lhcb3和叶绿素a加氧酶cao基因在低盐胁迫下的表达变化,以及盐藻类囊体膜的磷酸化水平和磷酯酶的变化.结果表明,在低盐环境下,lhcb3和cao基因的表达活性都呈降低的总趋势,这可能是盐藻适应不浓度盐环境胁迫的不反应.类囊体膜蛋白磷酸化水平先是降低,之后有所升高.时,发现磷酸酯酶有着相的变化趋势,并在12 h时最高.由此认为低盐条件下,类囊体膜蛋白在前期磷酸化水平的降低与磷酸酯酶活性降低有关,但在12 h后磷酸化水平有所升高,可能是细胞内平衡调节的结果,即磷酸激酶活性增强的结果.