萘降解质粒pND6的分离和鉴定

从工业废水中分离的假单胞菌 (Pseudomonassp .)ND6菌株 ,能以萘为唯一碳源生长 ,使无机盐培养基(MM)中 2g/L的萘在 48h内降解 98% .该菌株含有一个 115kb的大质粒pND6 .DNA杂交实验表明 ,pND6质粒含有与恶臭假单胞菌 (P .putida)G7菌株的NAH7质粒同源的萘降解基因 .图 3表 1参 14     

白菜叶绿体DNA快速提取及分析

采用SDS-蛋白酶法提取了白菜的叶绿体DNA.琼脂糖电泳及紫外分光光度分析表明,所提取的叶绿体DNA质量高,除cpDNA主环外,在胞质雄性不育新种质及原不育系中还存在约1375bp和831bp的两条质粒分子.用所提取的叶绿体DNA作为模板进行RAPD扩增,获得了清晰的扩增图谱.该方法与传统的提取方法相比省时、高效、无污染.图2表1参14     

快速提取用于PCR分析的几种蔬菜DNA的方法

利用两种不同的简便方法提取大白菜、大葱和厚皮酣瓜发芽种子的DNA,均能产生具有重现性的RAPD结果这两种方法提取DNA的PCR扩增结果与多次利用苯酚／氯仿提取DNA的结果一致.RNase处理与否对提取DNA的PCR扩增结果没有影响.方法1不用氯仿,但残留蛋白质等容易造成DNA溶解困难;方法2提取的DNA纯度高对于含蛋白质较少的植物器官或组织,可以选用方法1,而对于含蛋白质较多的植物器官或组织,宜选用方法2.两种方法提取的DNA量与用苯酚／氯仿提取DNA的量相似样品之间提取DNA量的多少主要受研磨破碎程度高低所决定.方法1每人每天提取约120个样品,方法2提取约100个样品,比先前的方法快1倍多.所提取的每个样品DNA约能用于100次PCR反应,两种DNA提取方法简便、迅速,为快速进行大量样品的PCR分析提供了条件.     

活性污泥宏基因组芯片DNA的制备方法

宏基因组芯片的探针是通过构建环境DNA的宏基因组文库而获得的,为了获得理想的活性污泥宏基因组文库和宏基因组芯片探针,必须获得高质量的活性污泥DNA.本文作者采用8种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过比较DNA总量、纯度、完整性、是否含有PCR酶抑制剂、能否进行限制性内切酶酶切等指标来评价不同提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明,溶菌酶-SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提处理活性污泥所提取的总DNA效果最好,提取的DNA总量多、纯度高,DNA片段大于23 kb,无需进一步纯化就可直接进行PCR扩增反应或SauA Ⅰ限制性内切酶酶切,但DNA如果需要EcoRⅠ、HindⅢ等限制性内切酶酶切,则需采用Roche公司琼脂糖凝胶回收试剂盒将DNA进一步回收纯化.图7表3参14     

A_2型高粱细胞质雄性不育系与其保持系的胞质DNA和核DNA差异

以高粱细胞质雄性不育系A2 V4 (A)及其保持系V4 (B)的总DNA为模板 ,对 184个随机引物进行筛选 ,找到6个其RAPD扩增产物在A/B间存在稳定差异的引物 .将该 6个引物同时扩增A/B的总DNA、线粒体DNA(mtDNA)及叶绿体DNA(cpDNA) .以总DNA为模板时得到 12个扩增片段 ,以mtDNA为模板时得到 4个 ,以cpDNA为模板时得到 11个 .结果分析表明 ,在这些扩增片段中 ,有 7个仅仅出现在以胞质DNA为模板的扩增中 ,有 5个在以总DNA和胞质DNA为模板时同时出现 ,即认为这 12个片段来自胞质DNA .另有 7个片段 ,在以胞质DNA为模板时未出现 ,而是仅仅出现在以总DNA为模板的扩增中 ,认为是来自核DNA .来自核DNA的 7个扩增片段中 ,有 5个来自保持系 ,有 2个来自不育系 ,这表明 ,不育系与保持系在核DNA上存在差异 .对A/B核DNA在CMS中的重要性及研究对策进行了讨论 .图 2表 4参 19     

基于16S rDNA-DGGE和FDC技术对富营养化湖泊不同生态修复工程区细菌群落结构的研究

于2005年10月在太湖梅梁湾水体生态修复工程区中采集不同生物净化区水样,直接提取水样中的总DNA,以细菌16SrDNA通用引物进行V3区PCR扩增,PCR产物经DGGE(变性凝胶梯度电泳)分离后,获得水体细菌群落的16S rDNA指纹图谱;并运用FDC(表面荧光直接计数)方法对不同生物净化区的细菌丰度进行了测定.结果表明,随着净化处理程度的增加,细菌群落多样性呈现上升趋势,DGGE条带从未实施生态修复的梅梁湾中的13条上升到沉水植物恢复区的25条;细菌数量的变化则呈现显著下降趋势,由工程区外围(重富营养区)的5.36×106cells/mL下降到生态修复区的2.06×106cells/mL.生态修复工程的实施改善了水体的生境条件,提高了水体的自净能力,促进了细菌多样性的恢复.图6表1参40     

天津市中心城区集中供应管网末梢水的抗生素耐药基因污染特征研究

为了研究天津市中心城区集中供应管网末梢水的抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)污染特征,采集了天津市中心城区6个采样点的管网末梢水样,分别采用微孔滤膜正压过滤法及核酸吸附-洗脱法富集水中细菌和胞外核酸后,利用实时定量PCR技术对15种胞内ARGs和胞外ARGs进行定量检测.结果表明,在待检的15种ARGs中,除了耐碳青霉烯类 blaKPC 未被发现外,其余 ARGs(mcr-1、vanA、blaNDM-1、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA、dfrA1、rpoB1、catA1、ermB、katG 和 qnrA)均在天津市中心城区所有管网末梢水样中检出,其中,mcr-1、vanA、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA和dfrA1等8种在细胞内外含量均较高,分别占待检的胞内ARGs和胞外ARGs总量的9725％和99.18％,以aadA最高,其次为blaTEM和sul1;细胞内ARGs总绝对浓度高于细胞外(P＜0.05),前者为后者的3.8倍.天津市中心城区集中供应管网末梢普遍存在胞内ARGs和胞外ARGs污染,且细胞内外超级耐药基因均有检出.     

水环境中耐热大肠菌群的抗生素耐药性与质粒谱研究

用滤膜法、mFC培养基从5种水体中分离出疑似耐热大肠菌162株,用API微生物分析系统鉴定到种,以Kirby-Bauer法分析其对人畜常用10种抗生素的耐药性,碱裂解法小量制备各菌株质粒DNA做质粒谱分析.结果表明,埃希氏大肠杆菌为优势菌,占分离菌总数的96.3%.除分离自泉水的3株外,其它菌株都对3种及3种以上抗生素耐药,多重耐药率为98.1%.不同水体分离菌株对氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素的耐药率有显著性差异(P<0.005).92株菌(56.8%)提取到大小为0.90～158.83kb、数量为1～6个的质粒,有81种质粒谱型.70株(43.2%)未提取到质粒的细菌中有67株为多重耐药.具有相同质粒谱型的菌株耐药谱都不相同.未发现质粒谱与抗生素耐药性间有明显相关性.图1表3参15     

宿根甘蔗根际土壤细菌多样性分析中培养法与非培养法比较研究

采用培养法和非培养法提取甘蔗根际土壤微生物的总DNA,基于通用引物PCR扩增构建两种方法的细菌16SrDNA文库,并进行核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA),通过部分克隆序列测定构建细菌克隆文库的系统发育树,进而对基于传统的细菌平板培养法和直接提取总细菌DNA的非培养法进行比较分析.结果显示,非培养法文库的香侬–威纳指数、辛普森指数、丰富度分别为4.94、0.998、28.91,均高于培养法文库中相应的多样性参数(分别为4.27、0.996、16.79),均一度数值都>0.95.结合统计学数据和序列测定信息,反映出甘蔗根际土壤存在着丰富的细菌多样性,但平板培养法所展现的多样性低于直接提取法,表明前者存在着很大的局限性,而非培养法文库中主要是未培养微生物的16S rDNA序列,这从一个侧面反映了土壤样品中未培养微生物占很大比例.因此,在土壤微生物群落研究中,必须结合新的分子生态学技术手段,如采用直接提取总DNA的方法进行研究,才能比较全面地认识土壤微生物多样性.图3表3参18     

A2型高粱细胞质雄性不育系与其保持系的胞质DNA和核DNA差异

以高粱细胞质雄性不育系A2V4（A）及其保持系V4（B）的总DNA为模板,对184个随机引物进行筛选,找到6个其RAPD扩增产物在A／B间存在稳定差异的引物,将该6个引物同时扩增A／B的总DNA、线粒线DNA（mtDNA）及叶绿体DNA（cpDNA）,以总DNA为模板时得到12个扩增片段,以mtDNA为模板时得到4个,以cpDNA为板时得到11个,结果分析表明,在这些扩增片段中,有7个仅仅出现在以胞质DNA为模板的扩增中,有5个在以总NDA和胞质DNA为模板时同时出现,即认为这12个片段来自胞质DNA,另有7个片段,在以胞质DNA为模板时未出现,而是仅仅出现在以总DNA为模板的扩增中,认为是来自核DNA,来自核DNA的7个扩增片段中,有5个来自保持系,有2个来自不育系,这表明,不育系与保持系在核DNA上存在差异,对A／B核DNA在CMS中的重要性及研究对策进行了讨论。     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

多环芳烃降解菌ZL5分离鉴定及其降解质粒

通过选择性富集培养，从辽河油田石油污染土壤中分离到一株多环芳烃(PAHs)降解菌ZL5．它能以菲和芘为唯一碳源生长，但是不能利用萘．16S rDNA核苷酸序列分析结果表明，ZL5属于变形细菌α亚类中的鞘氨醇单胞菌属．该菌株含有一个大小约为60kb的质粒．丝裂霉素C消除实验表明，随着质粒的丢失，菌株利用菲和芘的能力也丧失．用电转化和氯化铷转化法分别将菌株ZL5的质粒导人大肠杆菌JM109和DH5α中，随着质粒的获得，这些转化子获得了降解菲和芘的能力．本研究结果表明，鞘氨醇单胞菌ZL5降解PAHs的功能和质粒有关。     

DNA同源性分析最终确定新疆中华根瘤菌（Sinorhizobium xinjiangensis）为一独立种

针对S.xinjiangensis分类地位的争议,从新疆再次分离获得34株快生大豆根瘤菌,在16SrDNAPCR-RFLP分析和SDS全细胞蛋白电泳分群的基础上,进行了16SrDNA全序列相似性和DNA同源性分析.所测4个菌株和S.fredii模式菌株USDA205的16SrDNA全序列有很高的相似性.而DNA同源性分析说明新分离的菌株代表与原定的S.xinjiangensis为一个DNA同源群.其模式菌株CCBAU110与S.fredii的2株参比菌株USDA194、2048之间的DNA同源性分别为31.5%和28.7%.S.fredii的模式菌株USDA205与新分离的菌株代表及原定的S.xinjiangensis的模式菌株和2个参比菌株之间的DNA同源性为20.8%～39%,远低于70%.属于种水平上的差异.按照国际细菌分类委员会以DNA同源性≥70%且△Tm≤5℃作为定种的标准,S.xinjiangensis是Sinorhizobium属中不同于S.fredii的一个独立的种.表3参20     

16S rDNA克隆文库解析江汉平原高砷地下水系统中的细菌多样性

为研究江汉平原高砷地下水系统中细菌多样性和种群结构,以2011年11月采自江汉平原仙桃市沙湖镇高砷含水层沉积物为研究对象,沉积物采自同一50m钻井,分别选取埋深9.9～10.1m和15.7～16.0m样品。提取沉积物中总DNA,采用16SrDNA克隆文库方法,分析高砷含水层沉积物中土壤细菌的多样性。结果发现,伯克氏菌目(Burkholderiales)、假单胞杆菌目(Pseudomonadales)和肠杆菌目(Enterobacteriales)构成了高砷系统中抗砷的优势菌群。结果表明,高砷含水层中生活有大量微生物,这些微生物在砷的地球化学循环中扮演着重要角色。     

ERIC-PCR:一种快速鉴别环境细菌菌株的方法

以 Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ（ 肠杆菌基因间共有重多序列） 序列设计的特异引物对３ 株大肠杆菌、３ 株软腐欧氏杆菌、２ 株草生欧氏杆菌、１ 株梨火疫欧氏杆菌、１ 株催娩克氏菌、１ 株阴沟肠杆菌和９ 株具有降酚能力的细菌等２０ 种细菌的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 分析．每种菌株均存在数目不等的各自独特的带型,能够区分同一种类中极为相近的菌株．经多次重复,各特异性扩增的主要带型能重复稳定出现．聚类分析的结果表明,供试菌株多数按照分类地位归到相应的组中．９ 种具有降酚能力的细菌中,２ 种分离自处理焦化废水池活性污泥,７ 种来自土壤样品． Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ Ｐ Ｃ Ｒ 指纹图显示,前２ 种属于一类,都有一条大小约１ ．１ ｋｂ 的主带,其它７ 种土壤中分离出来的细菌除其中１ 种有１ 条约１ ．２ ｋｂ 大小的主带外,其余６ 种都有１ 条大小约１ ．４ ｋｂ 的带．聚类分析将从土壤中分离出来的细菌归为３ 种不同的类型． Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ Ｐ Ｃ Ｒ 可以从分子水平对细菌基因组进行快速指纹图分析,在对环境细菌分离物进行快速鉴定和归类等方面具有实用价值     

短小芽孢杆菌A—30耐碱性木聚糖酶基因的分子生物学研究

采用PCR方法对短小芽孢杆菌A－30菌株的耐碱性木聚糖酶基因进行克隆。在木聚糖选择平板上用刚果红染色法筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的重组质粒进行酶切鉴定和测序。该基因在大肠杆菌中表达,过夜培养物胞外、胞内和周质空间的木聚糖酶酶活分别为0．159IUmL^-1、0.322IUmL^-1和0.007IUmL^-1。此木聚糖酶表现出较宽的pH作用范围,最适作用pH7左右,在pH9时仍有60％以上的酶活性。图4参14     

Degradation of extracellular genomic,plasmid DNA and specific antibiotic resistance genes by chlorination

Extracellular DNA structure damaged by chlorination was characterized. Integrity of extracellular ARG genetic information after chlorination was determined. Typical chlorine doses will likely effectively diminish extracellular DNA and ARGs. Plasmid DNA/ARGs were less readily broken down than genomic DNA. The Bioanalyzer methodology effectively documented damage incurred to DNA. There is a need to improve understanding of the effect of chlorine disinfection on antibiotic resistance genes (ARGs) in order to advance relevant drinking water, wastewater, and reuse treatments. However, few studies have explicitly assessed the physical effects on the DNA. Here we examined the effects of free chlorine (1–20 mg Cl₂/L) on extracellular genomic, plasmid DNA and select ARGs. Chlorination was found to decrease the fluorometric signal of extracellular genomic and plasmid DNA (ranging from 0.005 to 0.05 mg/mL) by 70%, relative to a no-chlorine control. Resulting DNA was further subject to a fragment analysis using a Bioanalyzer, indicating that chlorination resulted in fragmentation. Moreover, chlorine also effectively deactivated both chromosomal- and plasmid-borne ARGs, mecA and tetA, respectively. For concentrations >2 mg Cl₂//L × 30 min, chlorine efficiently reduced the qPCR signal when the initial concentration of ARGs was 10⁵ copies/mL or less. Notably, genomic DNA and mecA gene signals were more readily reduced by chlorine than the plasmid-borne tetA gene (by ~2 fold). Based on the results of qPCR with short (~200 bps) and long amplicons (~1200 bps), chlorination could destroy the integrity of ARGs, which likely reduces the possibility of natural transformation. Overall, our findings strongly illustrate that chlorination could be an effective method for inactivating extracellular chromosomal- and plasmid-borne DNA and ARGs.     

基因间隔序列(ITS)在细菌分类鉴定和种群分析中的应用

Use of 16S -23S intergenic transcribed spacer (ITS) variability, as a relatively new method, is becoming an important supplement to the molecular methods based on 16S rRNA for which has a fairly constant size and is not divergent enough to give good separation in close relationships. This paper summarizes the structures and characteristics of ITS regions that are extremely variable in copy number, length and sequence per genome. The ITS region can be amplified easily taking advantage of conserved nucleotide stretches at the 5′of the 16S and 3′of the 23S gene, and the amplicon can contain different amounts of the 16S rDNA by choosing primers at different conserved areas within this gene. These primers are listed and discussed for perfecting the methodology of ITS. Furthermore, some recent progresses on the taxonomy, identification and community analysis of bacteria by means of ITS in epidemiology, ecology and artificial environment are reviewed, as well, the virtues and limitations of that method are discussed. Fig 2, Tab 1, Ref 51     

家猪基因指纹图的初步研究

寡核苷酸探针（CAC）5／（GTG）5检测了五指山猪、枫泾猪、枫泾猪与长白山猪杂交子一代的基因指纹图．各个体的可分辨谱带，分布于0．7～21．2kb之间．在约1．3kb处的一条共有谱带，可能是家猪的特征带．     

Isolation of a strain that degrades 1,2,4-trichlorobenzene and characterization of its degradative plasmid

The genetic information encoding metabolic pathways for xenobiotic compounds in bacteria often resides on catabolic plasmids. The aim of the present work was to know the location of the genes for degrading 1,2,4-trichlorobenzen. In this paper a 1,2,4-trichlorobenzene-degrading strain THSL-1 was isolated from the soil of Tianjin Chemical Plant using 1,2,4-trichlorobenzene as the sole carbon source. The strain was identified as Pseudomonas stutzeri through morphologic survey and 16S rDNA sequence determination. A plasmid was discovered from strain THSL-1 by using the alkali lysis method. When the plasmid was transformed into E. coli. JM109 by the CaCl2 method, the transformant could grow using 1,2,4-trichlorobenzene as the sole carbon source and had the degradation function of 1,2,4-trichlorobenzene. Therefore, it could be deemed that the plasmid carried the degradative genes of 1,2,4-trichlorobenzene. The average size of the plasmid was finally determined to be 40.2 Kb using selectively three kinds of restricted inscribed enzymes (HindIII, BamHI, and XholI) for single cutting and double cutting the plasmid pTHSL-1, respectively.