比较两种RAD54启动子调控的全酵母发光细胞对化学诱变原的评价效果

通过分子生物学技术构建2种不同RAD54启动子调控的yEGFP重组报告载体p RAD54-yEGFP和p RAD54S-yEGFP,前者启动子DNA为1.8 kb,后者为0.5 kb,分别转入W303-1A酵母细胞,构建2种启动子调控的发光酵母细胞,用不同化学诱变原作用后,用流式细胞仪和多功能发光仪测定酵母的发光强度。结果发现2种启动子调控的酵母细胞的发光强度均与化学诱变原(甲磺酸甲脂、4-硝基-N-氧化喹啉和5-氟尿嘧啶)有明显的剂量效应关系,但是W303-1A/RAD54-yEGFP剂量效应关系较为明显,产生的最大诱导倍数(5.96、2.19和2.71)明显高于W303-1A/RAD54S-yEGFP所产生的最大诱导倍数(2.53、1.50和1.91),可能与启动子序列中转录因子的数量以及转录因子间协同增效作用有关。同时发现,流式细胞仪测定效果明显优于发光仪测定效果。所以在构建RAD54启动子调控重组酵母细胞筛选诱变时,选用全启动子序列效果较好。     

高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用

利用PCR-mediated Technique对酿酒酵母W303-1A金属硫蛋白基因(cup1)进行敲除,获得一株铜离子敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A cup1△),其对Cu2+抑制浓度由1.2 mmol/L降为0.08 mmol/L;以pYX212载体为基本构架,以S.cerevisiae W303-1A cup1△为宿主菌,构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统,并成功表达了绿色荧光蛋白基因(gfp),从而实现了高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用.本研究构建的高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统不仅廉价、安全,而且丰富了酵母的表达系统,同时对微生物的铜抗性机理及生物修复功能的研究具有指导意义.     

产甘油假丝酵母抗逆转录因子的过表达对酿酒酵母耐酸胁迫性的影响

以具有优良环境耐受性的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)为研究对象,考察其抗逆转录因子对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酸胁迫耐受性的影响.分别克隆获得C.glycerinogenes和S.cerevisiae的转录因子基因haa1和asg1,在S.cerevisiae W303-1A中分别过表达这4个基因,继而进行摇瓶试验考察重组菌株的酸耐受性.结果显示,过表达不同转录因子均能提高细胞酸耐受性,其中90 mmol/L乙酸时重组菌S.cerevisiae/Cghaa1和S.cerevisiae/Cgasg1的生物量与S.cerevisiae/Schaa1和S.cerevisiae/Scasg1相比分别提高了44.3%和18.9%.q RT-PCR发现,与Schaa1和Scasg1相比,过表达Cghaa1和Cgasg1能够显著上调下游酸耐受相关基因的表达水平.酸胁迫下乙醇发酵结果显示,相比对照组,重组菌S.cerevisiae/Cgasg1的乙醇产量提高11.1%.上述结果表明转录因子HAA1和ASG1均能提高酿酒酵母酸耐受性和酸胁迫下乙醇产量,其中Cghaa1和Cgasg1效果更为明显,结果可为提高酿酒酵母酸耐受性提供新的基因资源和思路,为进一步挖掘C.glycerinogenes抗逆基因提供借鉴.     

利用纤维二糖的酵母工程菌构建

以扣囊复膜孢酵母染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增到其β-葡萄糖苷酶基因bgl1,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切并和经相同酶切的穿梭表达载体pYX212连接,构建了重组质粒pYX-sbgl,转化酿酒酵母W 303-1A,bgl1基因获得了活性表达,β-葡萄糖苷酶活力为0.504 IU/mL.转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长,并能应用于同时糖化和发酵纤维素底物生产乙醇,使乙醇产量较宿主酵母有了一定的提高.图6表1参14     

番茄SlNAC1基因启动子的盐应答功能分析

番茄NAC转录因子编码基因SlNAC1受假单胞菌、盐、干旱和低温等多种生物和非生物胁迫诱导表达,但其转录调控机制仍不清楚.为研究SlNAC1的盐应答转录调控机制,分离SlNAC1基因的启动子并分析其盐应答功能.构建4个5′-缺失的SlNAC1启动子(起始密码子上游2 039 bp、1 508 bp、1 373 bp和777 bp)驱动的GUS基因表达载体,并利用农杆菌介导法分别转化烟草(Nicotiana benthamiana),随后对转基因植株进行NaCl处理和GUS染色分析.结果显示,未经NaCl处理的转基因植株均不被明显染色,而NaCl处理后,除777 bp启动子转基因植株外,2 039 bp、1 508 bp和1373 bp启动子转基因植株都被明显染色.这说明SlNAC1启动子中盐应答元件位于-1 373 bp和-777 bp之间.结合该区间有4个盐应答元件——GT1GMSCAM4元件(核心序列为GAAAAA)的预测分析结果,推断这4个GT1GMSCAM4元件中的一个或者多个协同负责SlNAC1基因的盐应答转录调控.这4个GT1GMSCAM4元件将用于筛选SlNAC1盐应答的转录调控因子.(图4表1参28)     

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.     

渗透压调控启动子表达木糖醇脱氢酶基因XYL2对重组酿酒酵母木糖代谢的影响

渗透压调控启动子在高底物浓度或盐类物质诱导下可实现目标基因的高表达和可控表达,因此可用于构建新的代谢工程菌株.利用来源于可耐高渗的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)的渗透压调控启动子PCgSTL3、PCgZWF和PCgGPD,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中控制木糖醇脱氢酶基因XYL2的表达水平,并研究其在NaCl诱导下对木糖醇脱氢酶活性及重组酿酒酵母木糖代谢流的影响.结果显示,以组成型强启动子PTPI为对照,添加0.4 mol/L NaCl作为渗透压诱导剂后,渗透压调控启动子控制下的木糖醇脱氢酶活性均得到增强,其中在PCgGPD控制下其活性变化最为明显,酶活提高了2.8倍.同时,以PCgGPD控制XYL2基因表达的重组菌木糖消耗量、乙醇产量和产率均为最高,与无诱导剂相比分别提高了62.3%、30.7%和9.7%,副产物木糖醇产率最低,下降了53.3%.本研究表明,渗透压调控启动子PCgGPD可显著提高木糖醇脱氢酶活性,通过添加NaCl作为渗透压诱导剂可实现对XYL2基因的可控表达,显著降低木糖醇积累,提高乙醇产率.     

适用于流式细胞术的三角褐指藻核DNA染色方法

为制备可用于配置有488 nm激发器的流式细胞仪检测核DNA含量的三角褐指藻细胞,取对数生长期的三角褐指藻细胞,分别采用70%乙醇、1%戊二醛、1%甲醛溶液进行细胞固定,经RNase A消化后的样品用碘化丙啶(PI)染色,用SYBR-green I对未经RNase A消化的细胞染色,在荧光显微镜下观察细胞染色情况,用流式细胞仪检测细胞核DNA含量.结果显示:在荧光显微镜下观察到,3种不同固定液固定的细胞均表现为SYBR-green I只对藻细胞核染色,PI对于藻的细胞核与细胞质均有着色.流式结果的DNA直方图显示,SYBR-green I染色的细胞的DNA直方图有明显的G1与G2/M峰,拟合度(RCS)在3左右,变异系数(CV)在8.6%左右.而PI染色细胞的DNA直方图表现为变异系数值偏大,拟合度较低,没有明显的G1与G2/M峰.本研究表明,SYBR-green I是一种无需对细胞进行RNase A处理,可应用于配置有488 nm激光器流式细胞仪的核酸染料,可为研究在整个细胞周期的调控机制奠定基础,同时也为其他浮游植物细胞核的染色提供参考.     

细胞分裂素基因（T－cyt）在转基因烟草中的表达及其对生长发育的影响

将编码细胞分裂素合成关键酶──异戊烯基转移酶的Ｔ－ｃｙｔ基因分别置于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子，ｒｂｃＳ启动子和Ｔ－ｃｙｔ基因自身启动子的调控下，构建成不同的嵌合质粒用于转化烟草，通过ＰＣＲ检测，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＮＰＴⅡ的酶活检测对获得的转基因烟草进行了鉴定．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明：ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动下的Ｔ－ｃｙｔ基因在转基因烟草的根、茎、叶中均有ｍＲＮＡ的积累；ｒｂｃＳ启动子指导下Ｔ－ｃｙｔ基因在叶中转录较强，茎中次之，在根中几乎未表达．以根据抗原决定簇进行人工合成的复合抗原免疫家兔得到异戊烯基转移酶抗体，ＥＬＩＳＡ结果表明转基因烟草根中异戊烯基转移酶含量较高．Ｔ－ｃｙｔ基因的表达对转基因烟草的生长发育有明显影响：其叶绿素ａ、ｂ含量明显增加，叶衰老迟缓；顶端优势受到抑制，侧芽生长旺盛；与对照相比，其根系不发达．     

假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.     

应用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器筛选基因毒性化合物

为了扩展本实验室构建的响应于DNA损伤信号的超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器的检测范围并积累参考数据,为实际应用打下实验基础,本研究对26种与环境及人类生活息息相关的化合物的基因毒性进行了检测,筛选出8种具有基因毒性的化合物,并将其结果与现有微生物检测系统的检测结果进行了对比。结果显示,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器的检测结果与以细菌为宿主细胞的Ames试验或SOS显色法的检测结果的吻合度高于50%,与以酵母为宿主细胞的GSA检测系统的检测结果的吻合度高于85%。以真核生物酵母为宿主的检测系统与以原核生物细胞为宿主的检测系统的结果的差异反映了它们抗胁迫机制的不同。本研究应用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器特异性检测出3种化合物为基因毒性阳性,这3种化合物是代森锰锌、孔雀石绿及丙烯酰胺,均被报道具有潜在致癌性。本研究结果表明,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器可以有效地对环境污染有关的基因毒性化合物进行检测,可以作为其他现有检测系统的补充,应用于环境化学污染的健康风险评价。     

PCB118对GT1-7细胞GnRH分泌及Kisspeptin/GPR54信号通路蛋白表达的影响

为研究多氯联苯118(polychlorinated biphenyl 118,PCB118)对GT1-7细胞的毒性作用,探讨其对促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)分泌的影响及相关机制,在PCB118作用GT1-7细胞后,分析了细胞存活率、GnRH分泌水平以及Kisspeptin/GPR54信号通路中关键蛋白的表达水平。结果表明,PCB118(0.05～50 000 nmol·L-1)分别作用GT1-7细胞6、12、24和48 h后,细胞存活率随PCB118浓度的增加和作用时间的延长而显著降低。但只有在高浓度(50 000nmol·L-1)条件下,PCB118才能显著促进GT1-7细胞释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)。PCB118作用GT1-7细胞6 h后,5、500和50 000 nmol·L-1组能显著抑制GnRH的分泌,并降低Kisspeptin/GPR54信号通路中GnRH、G蛋白偶联受体54(G-protein-coupled receptor 54,GPR54)、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)等关键蛋白的表达水平;作用24 h,500和50 000 nmol·L-1PCB118能显著抑制GnRH的分泌,并降低GnRH、GPR54、PLC和PKC等关键蛋白的表达水平。研究表明:PCB118对GT1-7细胞具有细胞增殖毒性作用,呈现一定的剂量和时间效应; PCB118能在一定程度上抑制GT1-7细胞GnRH的合成与分泌,并下调Kisspeptin/GPR54信号通路中GnRH、GPR54、PLC和PKC等关键蛋白的表达水平,推测Kisspeptin/GPR54信号通路可能参与介导了PCB118对GT1-7细胞GnRH分泌的抑制作用。     

GCC盒和JERE盒介导的信号途径在水稻应答逆境中的作用

植物应答逆境的防御反应在很大程度是在基因转录水平调节的,其中转录因子与目标基因启动子上顺式作用元件的识别和结合起着关键的调节作用.本研究将从双子叶植物中发现的GCC盒(应答乙烯)和JERE盒(应答JA和激发子)与CaMV35S核心启动子融合构建成诱导型启动子,利用GUS报告基因构建其表达载体并进行农杆菌介导的水稻遗传转化.利用T1代株系分析了GCC盒和JERE盒水稻植株对不同逆境胁迫和激素处理的应答.结果表明在转基因植株中它们都具有很低的本底表达.稻瘟病侵染、稻纵卷叶螟取食和机械损伤处理可不同程度提高GUS基因的表达.另外,脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)也能提高GUS的表达.实验结果暗示JERE和GCC盒介导的信号途径在单子叶和双子叶之间有一定的保守性.图5参15     

Bioluminescence in the Monterey Submarine Canyon: image analysis of video recordings from a midwater submersible

Video images of bioluminescence were recorded in situ during a 1985 study of the midwater environment of the Monterey Canyon, using a single-person, untethered submersible. Gelatinous organisms were responsible for the most brilliant bioluminescent displays, often exhibiting elaborate kinetics in response to mechanical stimulation. Images of bioluminescent displays recorded from identified organisms are shown and display patterns are described. All bioluminescence emission spectra from captured specimens were blue, with peak emissions between 460 and 494 nm. Image-analysis of recordings of mechanically stimulated bioluminescence revealed source densities between 43 and 175 m^-3 and intensities between 2.5 and 37.3 W sr^-1 m^-3. The predominant display type at all depths studied (between 100 and 560 m) was luminous secretions. Despite high intensities of mechanically stimulated bioluminescence, no spontaneous light production was recorded in the absence of mechanical stimulation.     

5氟尿嘧啶对蛋白核小球藻和羊角月芽藻生长及叶绿素含量的影响

近年来,抗癌药的环境污染特征及其生态风险引起了广泛关注。为获取典型抗癌药5氟尿嘧啶的基础生态毒性数据,以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和羊角月芽藻(Selenastrum capricornutum)为受试生物,考察了5氟尿嘧啶对2种绿藻的生长和叶绿素含量的影响。结果表明,5氟尿嘧啶对蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生长具有抑制作用,随着暴露浓度升高,细胞生长抑制率增强。5氟尿嘧啶对2种绿藻的96 h半数抑制浓度(EC50)分别为450.36 mg·L~(-1)和692.30 mg·L~(-1),属于低毒性物质。暴露96 h后,低浓度5氟尿嘧啶(32 mg·L~(-1))对蛋白核小球藻和羊角月芽藻叶绿素含量有一定的促进作用,高浓度5氟尿嘧啶(32~500 mg·L~(-1))则抑制了2种绿藻的叶绿素含量,且两者具有明显的负相关关系。和叶绿素b相比,叶绿素a对5氟尿嘧啶胁迫更为敏感。     

离子液体氯化1-辛基-3-甲基咪唑对酵母细胞增殖生长和细胞膜通透性的影响

为探讨咪唑类离子液体氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C₈mim][Cl])对酵母细胞的增殖生长和细胞膜通透性的影响,以不同浓度的[C₈mim][Cl]处理酵母细胞,研究离子液体对酵母细胞增殖和菌落形成的影响,通过测定酵母细胞外液蛋白质和核酸的含量,判断膜通透性的大小和[C₈mim][Cl]对细胞膜性结构的损伤。结果显示,0.1 mmol·L^-1的[C₈mim][Cl]延长了酵母细胞到达对数生长期的时间,在6～9 h之间对酵母细胞的增殖存在明显的抑制作用。1 mmol·L^-1的[C₈mim][Cl]使酵母细胞增殖不能到达对数生长期,对酵母细胞的增殖一直具有较强的抑制作用。随着离子液体浓度的增加,小菌落的数量增多。当平板内[C₈mim][Cl]浓度达到10 mmol·L^-1时,完全抑制了菌落的形成。[C₈mim][Cl]处理酵母细胞后,细胞外液中OD₂₈₀、OD₂₆₀的值显著升高。研究表明,细胞膜等膜性结构通透性的增加是离子液体[C₈mim][Cl]抑制酵母细胞增殖生长的原因之一。     

Sch9蛋白激酶调控酵母细胞全蛋白的泛素化

为探讨蛋白激酶Sch9是否影响细胞蛋白质稳态水平及其在热胁迫时的响应,以野生型、SCH9基因缺失突变体、转sch9基因ΔSch9(SCH9-3HA)酵母为材料,利用特异的泛素抗体,检测长期培养时全蛋白泛素化水平变化.结果表明,Sch9缺失引起细胞全蛋白泛素化水平降低,转sch9基因可以使细胞全蛋白泛素化水平恢复.55℃热胁迫30 min处理,突变体Δsch9全蛋白泛素化水平降低,转sch9基因Δsch9(SCH9-3HA)全蛋白泛素化水平不变,回到正常生长温度时,蛋白泛素化水平也没有改变.外加蛋白酶体抑制剂MG132时,突变体ΔSch9蛋白泛素化水平不受影响,而转sch9基因△sch9(SCH9-3HA)全蛋白泛素化水平显著增加,表明前者是自噬途径降解,而增加部分是通过蛋白酶体途径降解.蛋白激酶Sch9调控细胞全蛋白泛素化水平,以及2个不同的降解途径.     

Improved degradation of azo dyes by lignin peroxidase following mutagenesis at two sites near the catalytic pocket and the application of peroxidase-coated yeast cell walls

• Mutations in Lignin peroxidase Trp171 environment improved azo dyes degradation. • Expression on yeast cell surface and cell lysis allowed reusability of biocatalyst. • Aga2-LiP chimeric variants were characterized. The enzymatic degradation of azo dyes is a promising alternative to ineffective chemical and physical remediation methods. Lignin peroxidase (LiP) from Phanerochaete chrysosporium is a heme-containing lignin-degrading oxidoreductase that catalyzes the peroxide-dependent oxidation of diverse molecules, including industrial dyes. This enzyme is therefore ideal as a starting point for protein engineering. Accordingly, we subjected two positions (165 and 264) in the environment of the catalytic Trp171 residue to saturation mutagenesis, and the resulting library of 10⁴ independent clones was expressed on the surface of yeast cells. This yeast display library was used for the selection of variants with the ability to break down structurally-distinct azo dyes more efficiently. We identified mutants with up to 10-fold greater affinity than wild-type LiP for three diverse azo dyes (Evans blue, amido black 10B and Guinea green) and up to 13-fold higher catalytic activity. Additionally, cell wall fragments displaying mutant LiP enzymes were prepared by toluene-induced cell lysis, achieving significant increases in both enzyme activity and stability compared to a whole-cell biocatalyst. LiP-coated cell wall fragments retained their initial dye degradation activity after 10 reaction cycles each lasting 8 h. The best-performing mutants removed up to 2.5-fold more of each dye than the wild-type LiP in multiple reaction cycles.     

Reductions in photosynthetic carbon uptake in epiphytic diatoms by water-soluble extracts of leaves of Zostera marina

A water-soluble fraction of green leaves of Zostera marina L. decreased carbon uptake rates in diatoms found as epiphytes at Roberts Bank (Lat 49°2N; Long. 123°8W) on the west coast of Canada. Extract concentrations of 11 to 1 g dry leaf ml^-1, added immediately before ¹⁴C-uptake was measured over a 3-h period, reduced uptake to 36 to 80% of controls, respectively. A lower concentration (0.6 g dry leaf ml^-1) reduced uptake significantly in only one of four cultures. Addition of the whole extract 3 d before carbon uptake was measured or in one-third doses, 0, 1, and 2 d before, resulted in inhibition similar to that observed when the whole extract was added immediately before the ¹⁴C.     

Planktonic ciliates in Southampton Water: abundance,biomass, production,and role in pelagic carbon flow

The abundance and biomass of marine planktonic ciliates were determined at monthly intervals at two stations in Southampton Water between June 1986 and June 1987. The two stations, an outer one at Calshot and an inner one at N. W. Netley, were subject to differing marine and terrestrial influences. The potential ciliate production at cach station on each visit was estimated from these data. Enumeration of ciliates and measurements of biovolume were performed on Lugol's iodinepreserved samples and potential production was calculated using a predictive relationship based on temperature and cell volume. Heterotrophic ciliate abundance and biomass were greatest at both stations during spring and summer months, with respective maxima of 16x10³ organisms 1^-1 and 219 g Cl^-1 recorded at N. W. Netley. Estimates of the potential production of the ciliate community ranged from <1 to 18 g Cl^-1 d^-1 at Calshot and <1 to 141 g Cl^-1 at N. W. Netley, with annual values of 2 and 9 mg Cl^-1 yr^-1, respectively. Abundances, biomass and potential production estimates were generally greater at N. W. Netley than at Calshot. Carbon flow through the ciliate community was assessed using annual production values from both this study and the literature. The annual ciliate carbon requirement was equivalent to 9 and 11% of annual primary production at Calshot and N. W. Netley, and potential annual ciliate production was equivalent to 34% and >100% of the energy requirements of metazoan zooplankton at these locations, although comprising only 8 and 10% of their available food.