过表达分支酸歧化酶编码基因ARO7对酿酒酵母抑制物耐受性的影响

利用纤维素原料生产乙醇一直是国内外研究的热点,但纤维素预处理过程产生的弱酸、酚类和糠醛等抑制物对酿酒酵母细胞生长和乙醇发酵具有抑制作用,因此,提高酿酒酵母细胞的环境胁迫耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的重要手段之一.对芳香族氨基酸代谢途径中分支酸歧化酶基因ARO7的过表达对酿酒酵母在胁迫条件下细胞生长和乙醇发酵性能的影响进行研究.结果显示,过表达ARO7的重组菌株在含有5.0 g/L乙酸的平板中生长优于对照菌株;在含有5.0 g/L乙酸的发酵培养基中进行乙醇发酵,过表达ARO7的重组菌株的发酵效率高于对照菌株,在菊芋秸秆水解液中ARO7过表达重组酵母菌株乙醇得率由对照的0.44 g/g提高到0.47 g/g葡萄糖,乙醇生产强度提高了22.38%.以上表明,ARO7的过表达可提高酿酒酵母在抑制物存在条件下纤维素乙醇的发酵效率.     

关键基因过表达提高酿酒酵母抑制剂耐受性及乙醇发酵性能

木质纤维素预处理过程中会产生多种抑制物,抑制酿酒酵母细胞生长及乙醇发酵性能,为挖掘耐性基因、构建新的菌株,进一步提高酿酒酵母对这些抑制物的胁迫耐受性,研究在硫酸锌添加条件下转录组学分析过程中筛选到的可能关键基因ADE17、SSZ1、SET5、PPR1、OGG1和YKL222C过表达对酿酒酵母环境胁迫耐受性的影响.结果显示,不同基因过表达对酿酒酵母在多种抑制物胁迫条件下生长性能的影响不同,其中ADE17过表达对菌株在乙酸、糠醛、苯酚、丙酸和氯化钠胁迫条件下的生长提升最显著,而OGG1和SSZ1过表达对菌株生长的影响相对较弱.进一步对菌株进行驯化,在混合抑制物条件下驯化得到的BADE17-2和BADE17-4菌株延滞期比对照菌株BADE17缩短23 h.上述研究表明,硫酸锌添加从多方面影响了酿酒酵母耐受性,且关键基因过表达对不同环境胁迫条件具有多样性的影响,并且通过基因过表达和驯化方式结合可进一步提高酿酒酵母环境胁迫耐受性,提高纤维素乙醇发酵效率.     

渗透压调控启动子表达木糖醇脱氢酶基因XYL2对重组酿酒酵母木糖代谢的影响

渗透压调控启动子在高底物浓度或盐类物质诱导下可实现目标基因的高表达和可控表达,因此可用于构建新的代谢工程菌株.利用来源于可耐高渗的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)的渗透压调控启动子PCgSTL3、PCgZWF和PCgGPD,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中控制木糖醇脱氢酶基因XYL2的表达水平,并研究其在NaCl诱导下对木糖醇脱氢酶活性及重组酿酒酵母木糖代谢流的影响.结果显示,以组成型强启动子PTPI为对照,添加0.4 mol/L NaCl作为渗透压诱导剂后,渗透压调控启动子控制下的木糖醇脱氢酶活性均得到增强,其中在PCgGPD控制下其活性变化最为明显,酶活提高了2.8倍.同时,以PCgGPD控制XYL2基因表达的重组菌木糖消耗量、乙醇产量和产率均为最高,与无诱导剂相比分别提高了62.3%、30.7%和9.7%,副产物木糖醇产率最低,下降了53.3%.本研究表明,渗透压调控启动子PCgGPD可显著提高木糖醇脱氢酶活性,通过添加NaCl作为渗透压诱导剂可实现对XYL2基因的可控表达,显著降低木糖醇积累,提高乙醇产率.     

高浓度氯化镍胁迫下酿酒酵母组蛋白H4K5去乙酰化调控金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白(MTs)具有重金属解毒功能.组蛋白乙酰化/去乙酰化是表观遗传因子之一,并且参与基因的表达调控.然而,组蛋白乙酰化/去乙酰化在真核生物响应氯化镍胁迫过程中对金属硫蛋白基因的调控作用还不清楚.以酿酒酵母突变株H4K5R(该菌株模拟组蛋白H4赖氨酸5去乙酰化的状态)为试验材料,采用流式细胞术检测不同浓度氯化镍处理下酵母细胞的死亡率,发现突变菌株的生长状态和细胞存活率明显优于野生型菌株BY4741;qRT-PCR检测5 mmol/L氯化镍处理后,酿酒酵母金属硫蛋白基因Cup1、Crs5、Sod1及转录因子Cup2的表达量.结果显示,高浓度氯化镍胁迫下,野生型菌株中基因的表达水平均显著降低;耐镍菌株H4K5R中,金属硫蛋白基因Cup1表达量上调7.4倍,Crs5表达量显著下调2.56倍,Sod1表达量不显著上调,转录因子Cup2表达量上调3.81倍,并且表达水平均显著高于镍处理后的BY4741.本研究表明突变菌株H4K5R具有较强的镍耐受性;镍胁迫下,突变菌株中金属硫蛋白Cup1与转录因子Cup2的表达变化趋势与BY4741相反,说明组蛋白H4K5的去乙酰化可能通过改变基因表达模式,从而在酿酒酵母响应镍胁迫时发挥重要的调控作用.(图6表1参38)     

高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用

利用PCR-mediated Technique对酿酒酵母W303-1A金属硫蛋白基因(cup1)进行敲除,获得一株铜离子敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A cup1△),其对Cu2+抑制浓度由1.2 mmol/L降为0.08 mmol/L;以pYX212载体为基本构架,以S.cerevisiae W303-1A cup1△为宿主菌,构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统,并成功表达了绿色荧光蛋白基因(gfp),从而实现了高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用.本研究构建的高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统不仅廉价、安全,而且丰富了酵母的表达系统,同时对微生物的铜抗性机理及生物修复功能的研究具有指导意义.     

细胞絮凝及硫酸锌对酿酒酵母乙酸胁迫耐性的影响

酿酒酵母细胞絮凝和外源添加锌离子对其环境胁迫耐受性都具有促进作用,为了解细胞絮凝形态对锌促进乙醇发酵的影响,比较硫酸锌添加对絮凝酿酒酵母SP SC01及其絮凝基因失活突变体SPSC01 FLO1Δ在乙酸胁迫条件下乙醇发酵的影响.结果显示,与野生型絮凝酵母相比,添加锌可更明显改善SPSC01 FLO1Δ在乙酸中的生长和发酵,在10 g L~(-1)乙酸存在的情况下,SPSC01在70 h消耗100 g L~(-1)葡萄糖,锌离子添加后可使发酵终点提前10 h,而SPSC01FLO1Δ在锌离子添加后发酵时间为48 h,可将发酵时间显著缩短138 h.这些结果表明,锌在酿酒酵母细胞缺少絮凝保护的条件下更能有效发挥作用,同时甘油、琥珀酸的增加在絮凝基因敲除突变体中更加明显.本文研究结果可为进一步利用絮凝及锌响应调控基因提高酿酒酵母的环境胁迫耐受性,提高燃料乙醇的生产效率奠定基础.     

稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建

分别克隆了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因XYL2,构建出重组表达质粒pACT2-xy11和pDR195-xy12,并使其分别转化酿酒酵母受体细胞.酶活测定结果显示,转化子中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主菌中得到活性表达.并将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆,进而构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5.kanR-x12,以期今后通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中,得到稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株.图3表1参15     

强化丙酮酸-CO2途径对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中辅酶NADH的有效供给影响1,3-丙二醇的产量和得率,通过在K.pneumoniae强化丙酮酸-CO2途径,以提高胞内NADH水平和1,3-丙二醇产量.将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W3 03)的甲酸脱氢酶基因fdh1和K.pneumoniae的丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl B在K.pneumoniae中过表达,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径.结果显示,单独表达fd h1、pfl B和共表达fhd1、pfl B基因的克雷伯氏菌与出发菌株相比,胞内NADH含量明显增加,1,3-丙二醇产量分别提高了8%、12%、18%,摩尔转化率分别提高了7.3%、13.2%、19.5%,除乙酸外其他副产物都有不同程度的降低.本研究表明,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径提高了NADH的再生效率,促进了1,3-丙二醇的合成.     

转录因子DREB、ERF和NAC在介导植物响应生物和非生物胁迫中的作用

生物和非生物胁迫是影响植物生长和造成农业减产的重要原因.近年来,已经鉴定了几个可以调控胁迫相关基因表达的转录因子.这些转录因子在控制植物生物系统转录重编程中起重要作用,能提高植物对生物和非生物胁迫的耐受能力.因此,识别和表征与植物胁迫反应有关的关键基因对增强转基因植物的胁迫耐受能力是必不可少的.本文介绍了DREB、ERF和NAC转录因子,重点介绍其在转基因植物增强对生物和非生物胁迫耐受性的潜力.     

产甘油假丝酵母甘油分解代谢CgGCY1、CgGCY2和CgDAK基因的克隆、敲除及其功能

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)能够利用甘油大量生长菌体而无有机酸、醇等代谢物积累,是潜在的优良宿主细胞.为了解C.glycerinogenes甘油分解代谢途径,成功克隆得到二羟基丙酮(DHA)途径的编码基因Cg GCY1、Cg GCY2和Cg DAK.利用"Ura-Blaster"敲除盒分别构建的缺失突变菌Cggcy1?/gcy2?和Cgdak?均不能在甘油培养基中生长.q RT-PCR及酶活测定结果显示,与葡萄糖培养相比,甘油培养下细胞通过强化糖异生、HMP途径积累生物量,下调EMP途径和副产物合成关键酶表达以弱化有机酸、醇的合成,同时上调TCA循环以补偿EMP途径下调带来的能量和还原力不足,使得生物量提高24.5%而不积累有机酸、醇等代谢物.以甘油为共底物进行木糖发酵,木糖醇产量和转化率达到39.4 g/L和89%,与葡萄糖为共底物相比分别提高了79%和32.8%.本研究表明C.glycerinogenes甘油分解代谢仅依赖于DHA途径,以甘油为共底物更有利于木糖醇的合成和转化;结果可为代谢改造C.glycerinogenes以甘油为共底物合成高附加值化合物打下基础.     

少根紫萍转录因子及其营养胁迫下的表达

少根紫萍(Landoltia punctata)是一种浮水生、多功能、高环境适应能力的能源植物,为了解其生理特性的分子机制,利用少根紫萍转录因子预测数据与拟南芥、水稻、玉米数据库数据进行宏观比较,并结合转录组测序技术对少根紫萍营养胁迫后转录因子表达分析.结果显示,少根紫萍有1 076个转录因子,分属于66个家族,其中在b ZIP、WRKY、AP2/ERFERF、MYB、NAC、MADS-box等家族基因数明显减少,一定程度上解释了浮萍高黄铜低木质素、难开花的生理特性;少根紫萍在营养胁迫下偏向上调AP2/ERF-ERF、MYB、bHLH家族特定基因和下调AP2/ERF-ERF、WRKY家族特定基因来响应营养胁迫,尤其是AP2/ERF-ERF、WRKY两个家族中特定基因表达下调在响应水体营养胁迫中有非常重要的作用.本研究在转录因子层面对浮萍的生理特性,特别针对营养胁迫下转录因子的表达进行了探究,可为建立浮萍水生模式植物系统、深入探讨少根紫萍响应营养胁迫机制以及改造成耐受胁迫的高效淀粉积累能源植物提供理论指导.     

木糖发酵酿酒酵母抑制物耐受能力提升及利用秸秆原料的乙醇发酵性能

木糖利用能力和抑制物耐受能力优良的工业酿酒酵母菌株以及合理的糖化发酵工艺是纤维素燃料乙醇生产的两个关键.对一株工业酿酒酵母菌的磷酸戊糖途径转醛醇酶基因TAL1进行差异过表达,评价其在8种典型抑制物存在时对菌株利用木糖的影响;利用TAL1过表达菌株研究油菜秸秆预处理物料中抑制物含量高低对分步糖化发酵(SHF)、预糖化-同步糖化发酵(P-SSF)和同步糖化发酵(SSF)3种不同糖化发酵方式发酵过程的影响,探讨高固含量发酵的可行性.结果显示,TAL1基因过表达提高了菌株的木糖代谢能力和对8种典型抑制物的耐受能力,适度过表达菌株表现最优,有抑制物存在时的木糖消耗速率提升了20%-70%.秸秆预处理物料中抑制物总含量约为4 g/L时,SHF无法正常发酵,SSF的乙醇收率接近70%,略高于P-SSF;当物料中抑制物总含量下降到约2 g/L时,3种方式都能顺利发酵,SSF表现最优,96 h时的乙醇收率为86.5%,但SSF(96 h)和P-SSF(112 h)所需糖化发酵总时间远低于SHF(144 h);总固含量约为25%的分批补料-同步糖化发酵(FB-SSF)的乙醇浓度和乙醇收率分别达到54.2 g/L和67.2%.上述结果表明,TAL1基因适度过表达提升了菌株的木糖发酵和抑制物耐受能力,菌株已具备比较优秀的发酵和耐受抑制物的能力;预处理物料中抑制物含量相对较高时采用SSF或P-SSF工艺,而抑制物浓度相对较低时,3种糖化发酵方式都可以采用,但SSF所需发酵时间最短,生产能力最高.     

木糖发酵酿酒酵母抑制物耐受能力提升及利用秸秆原料的乙醇发酵性能北大核心CSCD

木糖利用能力和抑制物耐受能力优良的工业酿酒酵母菌株以及合理的糖化发酵工艺是纤维素燃料乙醇生产的两个关键.对一株工业酿酒酵母菌的磷酸戊糖途径转醛醇酶基因TAL1进行差异过表达,评价其在8种典型抑制物存在时对菌株利用木糖的影响;利用TAL1过表达菌株研究油菜秸秆预处理物料中抑制物含量高低对分步糖化发酵（SHF）、预糖化-同步糖化发酵（P-SSF）和同步糖化发酵（SSF）3种不同糖化发酵方式发酵过程的影响,探讨高固含量发酵的可行性.结果显示,TAL1基因过表达提高了菌株的木糖代谢能力和对8种典型抑制物的耐受能力,适度过表达菌株表现最优,有抑制物存在时的木糖消耗速率提升了20%-70%.秸秆预处理物料中抑制物总含量约为4 g/L时,SHF无法正常发酵,SSF的乙醇收率接近70%,略高于P-SSF;当物料中抑制物总含量下降到约2 g/L时,3种方式都能顺利发酵,SSF表现最优,96 h时的乙醇收率为86.5%,但SSF（96 h）和P-SSF（112 h）所需糖化发酵总时间远低于SHF（144 h）;总固含量约为25%的分批补料-同步糖化发酵（FB-SSF）的乙醇浓度和乙醇收率分别达到54.2 g/L和67.2%.上述结果表明,TAL1基因适度过表达提升了菌株的木糖发酵和抑制物耐受能力,菌株已具备比较优秀的发酵和耐受抑制物的能力;预处理物料中抑制物含量相对较高时采用SSF或P-SSF工艺,而抑制物浓度相对较低时,3种糖化发酵方式都可以采用,但SSF所需发酵时间最短,生产能力最高.     

利用纤维二糖的酵母工程菌构建

以扣囊复膜孢酵母染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增到其β-葡萄糖苷酶基因bgl1,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切并和经相同酶切的穿梭表达载体pYX212连接,构建了重组质粒pYX-sbgl,转化酿酒酵母W 303-1A,bgl1基因获得了活性表达,β-葡萄糖苷酶活力为0.504 IU/mL.转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长,并能应用于同时糖化和发酵纤维素底物生产乙醇,使乙醇产量较宿主酵母有了一定的提高.图6表1参14     

比较转录组研究钛离子对紫花苜蓿基因表达的影响

钛离子可显著促进植物生长,增加作物产量.以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料,用钛离子水溶液(0,8 mg/L)喷施植株叶面,24 h后取样进行Illumina高通量RNA-Seq测序,研究钛离子对紫花苜蓿叶片基因表达的影响,在转录水平上研究钛离子作用的分子机理.以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)为参考基因组进行比对,结果显示,共获得28437个注释基因.差异表达分析表明,与对照相比,8mg/L钛离子处理引起大量基因表达发生变化,482个差异表达的基因中247个上调表达,235个下调表达. GO和KEGG注释结果显示,大量核糖体(18)、热激蛋白(7)、转录因子WRKY(5)类编码基因上调表达;尽管抗病相关基因上调的个数(11)低于下调的(22),但这些抗病相关基因的总体表达量,FPKM从12 563上升至16 197.下调的基因主要有细胞色素P450家族基因(上调2个,下调7个).推测钛离子作为一种胁迫信号刺激紫花苜蓿产生应答,引起基因表达发生变化,上调了与生长和胁迫适应相关基因的表达,进而促进植物生长和提高对逆境的耐受性.本研究为揭示钛离子调节植物生长的机制打下基础,为进一步钛离子制剂在农业生产中的应用提供指导.     

藜麦Hsf家族的进化与多胁迫条件下的转录应答

Hsf转录因子参与调控植物在生物和非生物胁迫下的防御应答机制.基于系统的生物信息学分析方法,对藜麦Hsf家族成员进行序列特征、进化和多种生物和非生物逆境胁迫下的基因表达水平分析.在藜麦基因组中共鉴定得到31个Hsf转录因子,主要分布在7号染色体.系统进化树将藜麦31个Hsf成员划分到A1-A9、B1-B5和C组中;但藜麦Hsf成员在A6、A8、B5亚组中出现了缺失.藜麦Hsf成员的HR-A/B区域蛋白序列比对结果进一步支持了进化树中藜麦Hsf成员的聚类结果.藜麦Hsf成员蛋白序列中保守区域的分布呈现出组别特异性.A组Hsf成员的蛋白序列包括HSF domain、HR-A/B、NLS、NES和CTAD在内的保守区域;B组和C组的Hsf成员则缺失了CTAD.在干旱、高温、盐、低磷胁迫和GCFSV病毒侵染下,31个藜麦Hsf基因的表达模式被阐明;其中大量Hsf基因的表达水平被显著地诱导表达,推测其参与了藜麦在生物和非生物胁迫下的防御应答反应.本研究结果可为藜麦抗逆品种的遗传育种提供大量优良候选Hsf基因.(图6表1参28)     

GCC盒和JERE盒介导的信号途径在水稻应答逆境中的作用

植物应答逆境的防御反应在很大程度是在基因转录水平调节的,其中转录因子与目标基因启动子上顺式作用元件的识别和结合起着关键的调节作用.本研究将从双子叶植物中发现的GCC盒(应答乙烯)和JERE盒(应答JA和激发子)与CaMV35S核心启动子融合构建成诱导型启动子,利用GUS报告基因构建其表达载体并进行农杆菌介导的水稻遗传转化.利用T1代株系分析了GCC盒和JERE盒水稻植株对不同逆境胁迫和激素处理的应答.结果表明在转基因植株中它们都具有很低的本底表达.稻瘟病侵染、稻纵卷叶螟取食和机械损伤处理可不同程度提高GUS基因的表达.另外,脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)也能提高GUS的表达.实验结果暗示JERE和GCC盒介导的信号途径在单子叶和双子叶之间有一定的保守性.图5参15     

海洋破囊壶菌△~5-延长酶和△~4-脱饱和酶在酿酒酵母中的共表达

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA C22:6n-3)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸.分别以质粒pYTFD5和pYFAD4为模板,扩增获得860 bp的△5-延长酶基因(elo5)和1 600 bp的△4-脱饱和酶基因(fad4).利用重叠延伸PCR构建elo5-fad4融合基因,Hind Ⅲ/Sph Ⅰ双酶切后连接到经同样处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYEL05-FAD4.转化酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株INVScl,通过缺少尿嘧啶的选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C20:5底物.半乳糖诱导表达.气相色谱-质谱分析表明,重组酵母总脂肪酸中出现了DHA(二十二碳六烯酸,C22:6n-63)新产物,融合基因elo5-fad4在酿酒酵母中得到了表达.图7表1参18     

过量表达沙冬青巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI提高大肠杆菌低温与热胁迫抗性

沙冬青是我国北方内蒙古荒漠地区特有的常绿阔叶灌木,具有很强的抗低温、干旱、盐碱能力,是重要的抗逆基因资源植物.将从低温诱导的沙冬青幼苗中克隆获得的巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI亚克隆后构建到原核表达载体pTWIN1上,得到重组表达载体pT-PI,双酶切及测序结果证明pT-PI已经构建成功.将pT-PI转入大肠杆菌ER2566中,经异丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE电泳检测发现有Mr35×103的目的融合蛋白表达,与预测结果一致,其中以在37℃诱导3～4h条件下表达量最高,表明目的基因AmPI在大肠杆菌中得到了成功表达.分别测定了低温(0℃)和热胁迫(50℃)条件下AmPI宿主菌的生存能力,结果表明AmPI的表达能提高宿主菌的存活率,可能是AmPI对细胞具有保护功能.     

利用细菌表面展示技术构建镉耐受性的重组根瘤菌

通过细菌表面展示功能基因InaXN、猴金属硫蛋白α亚基四聚体MT4α和两种启动子PnifH及Plac元件,分别构建两个重组质粒pTNIM和pBLIM.进一步通过三亲本杂交,将重组质粒分别导入费氏中华根瘤菌HN01,分别构建获得诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)和组成表达型重组菌HN01(pBLIM).在培养条件下比较测定重组菌和出发菌对镉的吸附能力和耐受性,结果表明,组成表达型重组菌HN01(pBLIM)在上述两个方面的能力得到明显增强,对镉的吸附富集能力提高了2倍.研究还发现重组根瘤菌也具有很好的静态吸附效果.盆栽实验结果表明,接种诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)的大豆根瘤和根中Cd2+的富集量均明显高于野生菌株HN01.本实验为后续探索重组根瘤菌与宿主植物共生体系在Cd2+污染土壤修复中的应用前景奠定了基础.