西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

深海沉积物微生物宏基因组文库中IMP环水解酶的筛选及基因克隆

为了解嘌呤合成途径的关键酶——IMP环水解酶的多样性,从深海沉积物样品中提取总DNA构建Cosmid宏基因组文库,从中筛选出一个具有IMP环水解酶活性的克隆(CAIMP1).通过基因步移的方法从CAIMP1的约35 kb的插入片段中扩增出长度为1 599 bp的完整的IMP环水解酶基因,该基因包含MGS和AICARFT_IMPCHas两个保守结构域.活性检测结果表明CAIMP1克隆的发酵液上清具有较强的IMP环水解酶活性.该酶与数据库中收录的IMP环水解酶的氨基酸序列同源性较低,系统发育分析也表明该酶与其它参照序列亲缘关系较远,表明该序列可能为一个新的IMP环水解酶基因.     

土壤宏基因组文库中纤维素酶的筛选与鉴定

纤维素酶是最重要的工业用酶之一,已广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤和生物燃料生产等多个领域中.为挖掘微生物来源的纤维素酶,基于功能宏基因组学的方法,筛选云南土壤宏基因组文库获得具有纤维素酶活性的阳性克隆;通过构建亚克隆和测序分析确定纤维素酶的编码基因,将其克隆到表达载体上并转化到大肠杆菌中构建重组表达系统,诱导蛋白表达后对纤维素酶酶学性质进行分析.通过筛选约65万个文库克隆,获得一个有纤维素酶水解活性的克隆,预测该纤维素酶基因全长为1 419 bp,编码蛋白分子量(Mr)为50.99×103,蛋白的氨基酸序列与Rhizobacter sp.S-16中的内切葡聚糖酶有88.66%的相似性,蛋白同源比对结果表明该酶属于糖苷水解酶第五家族(GH5),将其命名为YNEG5;对YNEG5的生化特性进行分析,确定其最佳反应温度为66℃,最适pH为4.8,该酶热稳定性良好且对工业试剂尿素具有较强的耐受性.本研究基于功能宏基因组学技术获得一个具有工业应用潜能的纤维素酶,可为不可培养微生物中纤维素酶的挖掘提供参考.(图10表1参36)     

基于序列筛选发掘宏基因组文库中的新颖卤化酶基因

绝大部分微生物的不可培养性使微生物的开发利用受到了限制,而宏基因组学策略为研究土壤中的不可培养微生物提供了途径.天然卤化物具有抗菌活性和抗肿瘤活性等生物活性,卤化酶在催化化合物的卤化过程中,对化合物活性产生重要影响,而以卤化酶基因为探针,可以发现与之偶联的天然生物合成基因簇,为卤化物的发现提供基础.利用卤化酶基因序列的保守区域设计简并引物,筛选土壤宏基因组文库获得卤化酶阳性克隆,并对获得的卤化酶基因间的进化及其与天然产物合成的关系进行分析.结果显示:通过同源序列筛选获得了65个卤化酶阳性克隆,序列同源分析表明约85%的阳性克隆中的卤化酶基因序列与已知卤化酶的相似性低,所获卤化酶基因具有较好的新颖性和多样性.而对所获克隆中生物合成相关基因的分析表明其中一个克隆中同时存在聚酮合酶基因与卤化酶基因,其可能与卤代I型聚酮合成相关.本研究基于序列筛选的方法,从宏基因组文库中发现了新的卤化酶基因和聚酮合酶基因,为进一步发现新颖的天然卤化物生物合成基因簇及天然卤化物奠定了基础.     

宿根甘蔗根际土壤细菌多样性分析中培养法与非培养法比较研究

采用培养法和非培养法提取甘蔗根际土壤微生物的总DNA,基于通用引物PCR扩增构建两种方法的细菌16SrDNA文库,并进行核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA),通过部分克隆序列测定构建细菌克隆文库的系统发育树,进而对基于传统的细菌平板培养法和直接提取总细菌DNA的非培养法进行比较分析.结果显示,非培养法文库的香侬–威纳指数、辛普森指数、丰富度分别为4.94、0.998、28.91,均高于培养法文库中相应的多样性参数(分别为4.27、0.996、16.79),均一度数值都>0.95.结合统计学数据和序列测定信息,反映出甘蔗根际土壤存在着丰富的细菌多样性,但平板培养法所展现的多样性低于直接提取法,表明前者存在着很大的局限性,而非培养法文库中主要是未培养微生物的16S rDNA序列,这从一个侧面反映了土壤样品中未培养微生物占很大比例.因此,在土壤微生物群落研究中,必须结合新的分子生态学技术手段,如采用直接提取总DNA的方法进行研究,才能比较全面地认识土壤微生物多样性.图3表3参18     

甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆

促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一是蔗糖合成酶,它也是蔗糖代谢关键酶中极其重要的一种酶.以甘蔗基因组DNA为模板,用PCR技术分段扩增并克隆了甘蔗蔗糖合成酶(Sucrose synthase)基因片段,并进行序列测序,表明该基因全长约为7.5 kb,与Lingle S.E等报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.5%,推导的氨基酸序列同源性达到100%.该序列包含约1.9 kb的上游启动子调控区域, 16个外显子, 15个内含子, 3'不翻译区等,开放读码框(ORF)编码802个氨基酸,氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr,为进一步在转录水平上阐明蔗糖合成酶的表达调控机制奠定了基础.     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16     

中度嗜盐菌Halomonas sp.BYS-1启动子的克隆和测序

提取了中度嗜盐菌Halomonassp.BYS1的基因组DNA,以甲基对硫磷水解酶基因(mpd)为报告基因,以启动子探针pUCmpd为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建了BYS1的启动子文库.通过筛选获得了17个阳性克隆,编号为P1～P17.测定了阳性克隆的甲基对硫磷水解酶(MPH)活性,结果表明,P3中mpd基因的启动子活性最强,它的酶活高达2554.3U/mg,而P17中mpd基因的启动子活性最弱,它的酶活只有68.3U/mg.对P3、P8、P17克隆中的重组质粒的插入片段进行了测序和在线启动子预测.图4表1参17     

宏基因组技术及其在环境保护和污染修复中的应用

宏基因组学是分子生物学技术应用于微生物生态学研究而形成的一个新概念,以环境中末培养微生物为研究对象,通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能.从1998年提出至今,该项技术已经广泛应用于工业、农业、医学等研究领域.文章在对宏基因组学的概念、研究方法、存在问题的综述基础上提出了相应的解决方法,并指出该技术在环境保护和污染修复中存在潜在的应用价值.利用该技术可以深入了解特定环境中微生物空间分布和动态变化,为环境监测、预警和评价提供理论依据.     

大庆油田聚合物驱后油藏微生物多样性研究

从大庆油田4个聚合物驱后的采油井中提取总DNA,扩增其16S rDNA片段,克隆到大肠杆菌,然后用ARDRA法对所得的298个克隆中的插入片段进行分析,建立了16S rDNA克隆文库.采用文库库容值(C)、香农-威纳指数(H)和均匀度指数(E)对文库微生物多样性进行了评价.结果表明,4个样品中共得出22个操作分类单元(OUT).其中4个OUT(在整个群落中占78.18%,9个OUT只有一个克隆.对22个OUT的代表克隆序列、GenBank数据库比对和系统发育分析表明,聚驱后油井中的细菌基本属于α变形菌纲(24.83%)、γ变形菌纲(23.49%)、δ变形菌纲(35.56%)和未培养微生物(16.78%).与石油烃降解和产生物表面活性剂相关的假单胞菌(Pseudomonas)和不动杆菌(Acinetobacter),在文库中占的比例分别是17.79%和6.02%.     

产大分子levan的果糖基蔗糖转移酶的原核表达及酶学性质

Levan型果聚糖是由微生物通过果糖组成的一个均聚物,寻找可以产均一度高的大分子果聚糖的果糖基蔗糖转移酶对其工业应用具有十分重要的意义.本研究克隆了来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,SCTCC102250)的果糖基蔗糖转移酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现表达.通过His-tag柱层析对表达的果糖基蔗糖转移酶进行纯化,将纯化的酶与底物蔗糖反应,经乙醇沉淀得到多糖样品,利用凝胶色谱法确定了其分子量(Mr)的大小为2×106.多糖酸水解后的样品Rt与果糖标准品的Rt保持一致,表明该聚合物为levan果聚糖.最后,通过研究果糖基蔗糖转移酶的酶学性质,确定其最适温度为40℃,最适pH为6.0,Km值为3.95 mmol/L,Vmax为1 31.58μmol m L-1 min-1.本研究通过酶法合成得到levan果聚糖,为今后制备大分子levan果聚糖提供了理论依据.     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

南极中山站排污口土壤中微生物群落的DGGE分析

以南极中山站排污口土壤为研究对象,提取样品中微生物宏基因组DNA,用变性梯度凝胶电泳(DGGE)对宏基因组DNA中的16S rRNA基因V3可变区进行分析,测定了31个不同条带所代表的序列.比较结果显示,排污口土壤样品与相同生境对照样品中的微生物类群组成均以CFB (Cytophaga-Flexibacteria-Bacteroides)类群和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)为主,另外还有少量的α-, β-, δ-变形菌纲,和一些原核的藻类和革兰氏阳性细菌(G ). 但在排污口土壤样品中检出了传染性微生物毛球菌属(Trichococcus)和狡诈菌属(Dolosigranulum),以及丰富的小球藻(Chlorella),说明污水的排放已经对该地微生物群落造成明显的影响.     

活性污泥宏基因组芯片DNA的制备方法

宏基因组芯片的探针是通过构建环境DNA的宏基因组文库而获得的,为了获得理想的活性污泥宏基因组文库和宏基因组芯片探针,必须获得高质量的活性污泥DNA.本文作者采用8种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过比较DNA总量、纯度、完整性、是否含有PCR酶抑制剂、能否进行限制性内切酶酶切等指标来评价不同提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明,溶菌酶-SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提处理活性污泥所提取的总DNA效果最好,提取的DNA总量多、纯度高,DNA片段大于23 kb,无需进一步纯化就可直接进行PCR扩增反应或SauA Ⅰ限制性内切酶酶切,但DNA如果需要EcoRⅠ、HindⅢ等限制性内切酶酶切,则需采用Roche公司琼脂糖凝胶回收试剂盒将DNA进一步回收纯化.图7表3参14     

稻—稻—油菜轮作土壤细菌群落的特征

为了解南方地区稻—稻—油菜轮作后土壤中细菌群落的变化特征,以长达30年的水稻—水稻—油菜轮作和水稻—水稻连作定点栽培试验土壤为研究对象,采用克隆文库和基因序列分析法,通过细菌16S r DNA基因通用引物对土壤提取DNA进行PCR扩增,然后将扩增片段构建克隆文库对克隆子进行测序分析.结果显示,2015年7月、10月和2016年4月3次取样中轮作土壤细菌的香农-维纳指数和辛普森指数均高于连作土壤,轮作土壤细菌多样性高于连作.克隆子序列OTU与Gen Bank比对结果显示,轮作土壤中常见的变形菌(Proteobacteria)占细菌种类的55%,连作土壤为45%;轮作土壤芽单胞菌(Gemmatimonadetes)占细菌种类的13%,连作土壤为10%;轮作土壤中的酸杆菌(Acidobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)和浮霉菌(Planctomycetes)所占细菌比例数小于连作土壤;变形菌和芽单胞菌构成了轮作土壤中的优势菌群,土壤优势菌群的变化对细菌群落结构特征产生影响.测序结果显示稻—稻—油菜轮作土壤优势菌群中α-变形菌、β-变形菌和γ-变形菌高于稻—稻连作;稻—稻—油菜轮作中发现与绿弯菌(Chloroflexi)序列相似菌类,而稻—稻连作土壤中未发现.本研究表明微生物群落结构组成与土壤耕作方式相关,稻—稻—油菜轮作增加了细菌群落丰度.     

Gateway技术构建盐和干旱胁迫下水稻根系混合cDNA文库及其质量鉴定

为研究水稻非生物胁迫响应信号转导的网络途径,揭示水稻抗逆的分子机制,以NaCl胁迫、干旱胁迫处理及正常生长的水稻根系为材料,采用Gateway技术构建了水稻根系受盐和干旱诱导的混合cDNA文库.cDNA文库质量分析表明,未经扩增的原始文库容量为1.5×106 cfu,插入片段大小主要为1 kb左右,重组率为100%.文库随机挑选克隆测序,结果显示插入序列完整性良好,文库中包含水解酶基因、逆境响应蛋白基因、氧化还原酶基因和富含甘氨酸的RNA结合蛋白质基因等.因此,本研究构建的盐和干旱诱导的水稻根系混合cDNA文库符合高质量文库的标准,可以用于进一步开展相关基因的克隆及功能研究.     

转座子挽救法克隆鞘氨醇单胞菌CDS-1中呋喃丹水解酶相关基因

用含Tn5转座子的自杀性质粒pSC123诱变呋喃丹降解菌Sphingomonas agrestis CDS-1,获得失去呋喃丹降解功能的突变株CDS-M1.以pMD18-T为载体在E.coli DH5α中构建了CDS-M1的基因组文库,采用转座子挽救法对Tn5插入位点两侧翼的序列进行克隆与测序,根据测序结果(共4 551个碱基)设计引物,从CDS-1的基因组中扩增到同样大小的片段,把该片断克隆到广宿主载体pPZP201上,得到重组质粒pCDZ1,通过三亲接合的方法把pCDZ1导入CDS-M1中进行功能互补实验,结果显示CDS-M1的呋喃丹水解功能得到了恢复,表明该片断中包含呋喃丹水解酶相关基因.图7表1参14     

纳米银与银离子对土壤微生物及酶活性的影响

为研究纳米银和银离子对土壤微生物的影响,采用土壤培养方式,对不同剂量纳米银(10、50、100 mg·kg~(-1))和银离子(1、5、10 mg·kg~(-1))暴露下黄褐土、砖红壤中可培养微生物数量及土壤酶活性(脲酶、荧光素二乙酸酯水解酶、蔗糖酶、过氧化氢酶)进行研究,并采用纯培养方法对纳米银和银离子暴露下的大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)凋亡情况进行检测,对纳米银释放的银离子毒性进行评估。结果表明,随着纳米银剂量的增加,土壤可培养微生物数量显著减少,脲酶和过氧化氢酶活性降低,蔗糖酶、荧光素二乙酸酯水解酶(FDA酶)活性没有显著变化;银离子处理中微生物数量明显减少,但土壤酶活性被激活。10 mg·L~(-1)纳米银暴露1 h后大肠杆菌、金黄色葡萄球菌凋亡率、死亡率增高;随着培养时间的延长,纳米银缓慢释放银离子,并促进大肠杆菌的凋亡。综上分析,纳米银能够抑制土壤可培养微生物生长和酶活性,其中脲酶、过氧化氢酶对纳米银较为敏感,蔗糖酶、FDA酶受纳米银的影响较小;纳米银的毒性一方面是其本身的特异抗菌性,也有部分来自缓慢释放的银离子。     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅡ cDNA片段克隆与表达分析

蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)是蔗糖合成途径的关键限速酶,在蔗糖积累和碳分配中具有重要作用.在茎组织中SPSⅡ表达量占SPS转录总量的40%,表明SPSⅡ cDNA的克隆与表达对蔗茎中蔗糖的积累有着重要的影响.通过RT-PCR技术克隆分离SPSⅡ基因cDNA片段.序列分析表明该cDNA片段包含1个3 183 bp的开放读码框,可编码1 060个氨基酸.GenBank登录号为EU269038.通过实时荧光定量PCR检测SPSⅡ基因在甘蔗糖分积累的不同时期、不同组织部位的相对表达量.结果表明,在糖分积累初期蔗茎中的SPSⅡ相对表达量最大,在糖分积累中期蔗叶中的SPSⅡ相对表达量达到最高峰;同组织部位中,糖分积累初期SPSⅡ相对表达量高于糖分积累中期、后期.图6参11     

改变碳输入对太岳山油松林土壤酶活性的影响

土壤酶是土壤微生物作用于土壤环境的媒介,其活性对土壤环境的变化十分敏感,因此测定土壤酶活性对了解土壤微生物群落功能与环境因子的关系具有重要意义.为了解碳输入变化对土壤酶活性的影响,本文以山西太岳山油松(Pinus tabulaeformis)天然林和人工林为研究对象,自2009年7月开始进行对照(无人为干扰,CK)、去凋(去除凋落物,LR)、切根去凋(切断根系并去除凋落物,LRNR)3种处理,于2012年7、9月和2013年5月采集表层0-20 cm的土样,测定了多酚氧化酶(Polyphenol oxidase)、过氧化物酶(Peroxidase)、纤维素酶(Cellulase)、蔗糖酶(Invertase)、脲酶(Urease)和中性磷酸酶(Neutral phosphatase)的活性,另于2012年10月采集表层0-20 cm的土样测定土壤化学性质.结果显示:碳输入的改变对土壤酶活性影响显著,去凋处理和切根去凋处理均显著降低了土壤碳、氮含量(P0.05),并且显著抑制了土壤纤维素酶、蔗糖酶、脲酶、中性磷酸酶等水解酶的活性(P0.05),但对多酚氧化酶和过氧化物酶等氧化酶的影响不显著(P0.05).切根去凋处理对水解酶的抑制作用大于去凋处理,并略微提高了土壤过氧化物酶活性.另外在天然林中蔗糖酶活性的下降比人工林更为显著,而人工林中纤维素酶活性的下降比天然林更显著.研究表明:油松天然林中的土壤微生物群落功能倾向于分泌蔗糖酶,而油松人工林中的土壤微生物群落功能倾向于分泌纤维素酶.土壤酶活性的变化说明,在山西油松林,碳输入的减少会降低参与有机质降解的土壤酶活性,而对参与腐殖质合成的土壤酶活性没有显著影响.图3表3参31