基于山桐子转录组序列的SSR分子标记开发

为研究山桐子遗传多样性,对山桐子转录组数据进行分析,开发SSR分子标记技术.将山桐子高通量转录组测序获得的84 213条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性.通过软件分析,共获得含SSR位点的序列数23 077,出现频率为27.40%,涉及序列数量为29 953条,发生频率为35%.SSR序列中包括1 620种重复基元类型,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为9 782(32.67%)、6 921(23.11%)和5 420(18.10%).单核苷酸中A/T类型比例最高,为9 630(32.15%),二核苷酸和三核苷酸中以类型AG/CT(4 679;15.62%)和AAG/CCT(1 220;1.53%)为主.SSR位点重复次数差别较大,主要是3次(4 748;15.70%),其次为6次(3 707;12.25%)和5次(3 475;11.60%).运用多态性分析的方式初步验证SSR位点在不同地区山桐子标记中的可行性.同时,利用Primer 5.0进行引物设计,随机筛选100对引物进行验证,31对引物可以扩增出条带,19对引物扩增出预期大小的条带,8对引物能特异性区分宜宾、资阳、宁强、成都4个不同地区的山桐子.本研究通过分析山桐子高通量转录组序列的SSR信息,筛选出8对引物验证不同地区山桐子的遗传多样性,将有助于山桐子基因挖掘、分子标记育种和资源保护等后续工作的开展.     

杏鲍菇转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为了开发杏鲍菇分子标记,利用前期高通量测序技术获得的杏鲍菇转录组数据,采用生物信息学软件Trinity拼接,然后通过MISA软件检索并分析杏鲍菇转录组简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)位点.共获得45 833条unigene,在其中的3 256条unigene中检测到3 811条符合软件参数的SSR序列,发生频率为8.31%.SSR位点平均长度为15 bp,平均分布频率是1/15.91 kb.在杏鲍菇转录组的SSRs中,单核苷酸与三核苷酸重复基元为主要重复类型,分别占总SSRs的45.24%和35.53%.SSR基元的重复次数为5-24次,其中5次或10次重复是发生频率最高的,SSR重复基元共有85个类型,其中A/T是最常见的重复基元,比例为38.97%,其次为AG/CT,比例为8.24%.对3 811个SSR位点设计出3 644对SSR引物,随机选择20对引物进行PCR扩增,其中9对在3个杏鲍菇品种中表现出多态性.本研究表明杏鲍菇转录组SSR位点多态性丰富,具有较高的应用潜力.     

中国大麦育成品种(系)的遗传多样性

为了解我国大麦育成品种(系)的遗传基础现状,利用位于大麦7个连锁群上不同位置的25对SSR引物对来自国内不同区域的大麦推广和新育成品种(系)的遗传多样性及其亲缘关系进行分析.结果表明,25对SSR引物在73个大麦品种间均有多态性扩增,每一对引物检测到的等位基因数目在2-6之间,平均为3.92个.SSR引物的多态性信息含量(PIC)变幅为0.252-0.780,平均为0.569.遗传多样性分析发现,我国不同大麦产区的皮大麦品种(系)间遗传相似性系数(GS)变化范围为0.661-0.767(平均值0.714),青藏高原地区青稞品种(系)间遗传相似性系数变化范围为0.533-0.925(平均值0.699),表明目前国内皮大麦和青稞的遗传多样性均较差、品种遗传背景单一.通过聚类分析,在遗传相似系数0.671水平处,42份皮大麦材料聚为2大类;在遗传相似系数0.618水平处,31份青稞材料聚为5大类,来源地相同的材料通常聚在同一大类或亚类,材料聚类结果与其地理来源有一定相关性.本研究表明SSR标记具有较好的遗传变异检测能力,对大麦品种(系)间的遗传多样性评价可为我国大麦育种过程中亲本材料的选择和利用提供重要依据.     

糯稻和非糯稻蜡质基因的新STS分子标记

通过对前人公布的糯性水稻蜡质基因全序列测定结果的分析,根据糯性水稻与非糯性水稻蜡质基因序列位点的差异,设计了两个基于PCR扩增反应的可特异识别糯性水稻的显性和共显性STS分子标记;同时在前人公布的非糯性水稻蜡质基因的不同类型(Wxa和Wxb)的全序列比对分析的基础上,选取了两种基因型特定的差异位点,设计了两个基于PCR扩增反应用于特异识别这两种Wx基因的显性STS分子标记,并用新建立的标记对相应的水稻基因型进行了检测.图2表2参10     

基于EST-SSR标记的沙棘品种鉴定及指纹图谱构建

以沙棘(Hippophae rhamnoides)优良品种“实优1号”为材料,对其叶片进行转录组测序,利用微卫星识别软件(microsatellite identification tool, MISA)和Primer 3(version 2.3.4)对获得的序列进行简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)位点挖掘和引物设计,以收集的42份沙棘品种为研究材料,开展聚合酶链式反应(PCR)和毛细管电泳检测,旨在开发一套多态性高、稳定性好和通用性强的表达序列标签微卫星(express sequence tags from simple sequence repeat, EST-SSR)引物,构建沙棘指纹图谱,从而实现沙棘品种的快速准确鉴定,并对沙棘品种间亲缘关系进行分析。“实优1号”转录组测序共获得6 196个SSR位点,其中,重复基元类型为182种,SSR基序长度主要分布在10～21 bp区间,占全部SSR的81.58%,主要SSR重复类型为单核苷酸重复(48.72%)、二核苷酸重复(22.68%)和三核苷酸重复(18.85%)。利用筛选出的28对引物在42...     

柚类资源及其近缘种SSR标记的分子评价

采用31对SSR引物对122份柚类种质资源及其近缘种的遗传多样性进行了研究.31对SSR引物可以检测到335个等位基因变异,平均每个位点可检测到9.85个等位基因.每个位点多态性信息指数(PIC)平均值为0.7085.从这些引物中有效地筛选出21对高信息量SSR引物,与31对引物在122份柚类资源间遗传关系达到极显著相关(r=0.99104).柚类资源及其近缘种等位基因平均数(A)、平均杂合位点百分比(P)、SSR表型杂合度(H0)分别为2.8、83.54%、0.524.用UPGMA方法将122份研究材料分成7个组群,110个柚类品种在相似系数0.712时可细分成18个亚组,分类结果有利于今后有目的地利用这些丰富育种材料的遗传背景.图3表2参21     

基于中华猕猴桃“红阳”转录组序列开发EST-SSR分子标记(英文)

为开发猕猴桃EST-SSR标记,了解28个品种猕猴桃间的遗传多样性和遗传关系,对中华猕猴桃"红阳"的转录组序列进行分析,并根据分析结果设计SSR引物.之后采用CTAB法提取28个品种猕猴桃的DNA作为SSR-PCR的扩增模板,并根据扩增结果进行聚类分析.研究中共得到包含SSR的序列21 848条,其中重复单元为单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的序列分别为1 642、15 965、3 141、248、368和484条,随机选择其中46条序列设计SSR引物.根据初步的PCR扩增,筛选出32对条带较少且明亮的引物分别对28个品种猕猴桃的DNA样本进行扩增,并对引物对应的SSR序列进行定位.结果显示,32对引物对应的序列中有19条能够得到完整的所在基因、染色体以及染色体中具体位置的信息.这些引物中有26对具有多态性,共统计到等位基因120个,每对引物得到1-11个等位基因,平均3.75个.28个猕猴桃品种之间的遗传相似性系数在0.53-0.97之间,在遗传相似系数为0.72的水平上,可将它们分为5大类,分类结果与传统形态学的划分基本一致.本研究揭示的各样本间的遗传关系可为未来猕猴桃的种质改良提供依据.图4表5参33     

濒危植物厚朴SSR引物筛选及反应体系优化

探索适宜厚朴(Magnolia officinalis)简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)-聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的最佳条件.在SSR引物筛选基础上,利用正交试验设计对影响PCR反应的5个因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq酶催化活性浓度)进行4个水平的优化,并通过温度梯度试验优化引物退火温度.在厚朴及其近缘物种的70对引物中,筛选出13对扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物.PCR各因素在不同水平下对反应体系的影响由大到小依次为引物浓度、Taq酶催化活性浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和模板DNA浓度.PCR最佳优化体系:25 μL体系中,模板DNA质量浓度为2 ng·μL-1,引物浓度为0.6μmol·L-1,Mg2+浓度为2.0 mmol·L-1,dNTPs浓度为0.5 mmol·L-1,Taq酶催化活性浓度为0.03 U·μL-1(1U=16.67 nkat).最佳扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,48.0～59.0℃(退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环后72℃延伸10 min.上述结果可为利用SSR-PCR技术研究濒危厚朴群体遗传学和分子生态学提供技术参数.     

甘蔗SCoT-PCR反应体系优化与多态性引物筛选及应用

目标起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism,SCoT)分子标记是一种新型的标记,结合了ISSR标记和RAPD标记的优点.本研究针对SCoT-PCR反应体系的影响因素,以甘蔗叶片DNA为材料,在单因子实验的基础上,采用L16(45)正交实验设计,进一步探讨了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶等5个因素对甘蔗SCoT-PCR扩增效果的影响,建立了甘蔗SCoT-PCR的优化反应体系.25μL PCR反应混合液中,含50 ng DNA模板、2.0μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)、0.625 U Ex Taq酶,dNTP和引物的终浓度分别为0.22 mmol/L和0.9μmol/L.以我国种植面积最大的栽培品种新台糖22号为模板,应用优化体系,对40条SCoT标记引物进行测试,筛选出16条有效扩增的引物,且均为多态性引物,其GC含量在50%～67%之间.该体系的稳定性和SCoT标记引物的扩增能力,通过基于随机选择的4条引物对9份具有地理来源和遗传背景不同的甘蔗种质进行标记分析来验证,结果共扩增出84条带,其中多态性条带占82.14%,平均单条引物可扩增出21条.研究结果为在甘蔗上进一步开发和应用功能性SCoT标记奠定了基础.     

胡枝子叶片转录组特征分析及其EST-SSR标记开发（英文）

胡枝子(Lespedeza bicolor)系豆科胡枝子属植物,性耐旱,是防风固沙及水土保持的优良植物.报道胡枝子的转录组序列,对其进行注释,并开发一系列EST-SSR标记用于进化研究.主要研究结果如下:(1)采用二代测序技术对胡枝子叶片进行转录组测序,得到120 913 unigenes,其平均长度为608 bp,N50的长度是978 bp.(2)分别在KEGG和KOG等数据库中对unigenes进行注释,总共注释72 613(60.05%)unigenes的功能.(3)筛选识别13 551个潜在的EST-SSR标记;根据重复单位的核苷酸数目以及重复次数的多少,从中选择173个EST-SSR标记进行引物设计.(4)对胡枝子和其他9种近缘种植物进行PCR扩增实验,最后得到56对引物可全部成功扩增出条带并表现出一定的多态性.本研究获得了较高质量的胡枝子转录组数据库,可进一步用于比较和功能基因组研究以及胡枝子及其近缘类群的基因表达研究;开发的EST-SSR标记将提供一个强大的工具,可用于研究遗传多样性和种群结构、构建DNA指纹图谱数据库、生成遗传图谱、预测分子标记辅助育种和保存遗传信息.     

用SSR标记检测杂交籼稻三系亲本的遗传差异

随机选用分布于水稻(Oryza sativa L.)12条染色体上的110对引物,共筛选出26对具有多态性的SSR引物,对24份杂交籼稻三系亲本材料进行遗传多样性和亲缘关系分析.全部24份亲本中共检测出116对等位基因,每个SSR引物可检测到的等位基因数目为2～7个不等,平均每对引物可以检测到4.4个等位基因.多态信息量(PIC)的变动范围为0.068 9～0.803 6,平均PIC值为0.603 4;期望杂合度(He)的变动范围为0.081 6～0.829 8,平均值为0.616 9;多样性指数(1)变幅为0.173 2～1.791 3,平均为1.160 0.对供试亲本材料根据遗传距离进行UPGMA聚类分析,结果表明,SSR微卫星标记可以将24份亲本材料分为3个大群,各组亲本间的遗传差异较大.通过分子标记辅助育种,可以有效地鉴定供试亲本材料之间的亲缘关系,分析预测新种质材料的遗传差异,可作为选育强优势组合杂交水稻的重要参考指标之一.图2表3参24     

产生全雄子代罗非鱼亲本的分子标记及其遗传多样性分析

通过1对1的配对实验,选取产生全雄性杂交子一代的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼亲本,对其进行RAPD分析.在40个引物中筛选出22个重复性好的引物用于两个亲本群体的分子标记和遗传多样性研究,其中5个引物(S236、S328、S471、Opz6、Opz8)扩增出的特异性DNA片段,可以作为区分两个亲本群体的分子标记.在奥利亚罗非鱼群体内,共检出133个位点,多态位点数15,多态位点比例为11.28%,在奥利亚罗非鱼群体内,共检出134个位点,多态位点数26,多态位点比例为19.40%.两个亲本群体内较高的遗传相似指数(S分别为0.9787、0.9462),说明两个群体内的遗传变异较小,纯度高;奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的种间遗传距离较大(D=0.2595),表明有产生较强杂种优势的可能     

小麦高分子量谷蛋白亚基基因的PCR及AS-PCR标记

选用高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)在Glu-D1位点已知的 26个普通小麦品种,包括 15个 (TriticumaestivumL. )川育系列品种及其 11个亲本,根据其亚基Dx5和Dy10基因的特异序列设计引物.通过对Dx5基因的PCR扩增及对Dy10基因的AS-PCR扩增,结果表明,所设计的引物对Dx5和Dy10都能扩增出特异条带,而携有Dx5基因的材料同时也携有Dy10基因.说明用所设计的引物可快速有效的鉴定出普通小麦中是否带有优质的 5 10亚基.图 4参 15     

黄连木居群遗传多样性的SSR标记分析

为系统揭示黄连木天然居群在遗传多样性水平上的差异及遗传分化状况,采用SSR(Simple sequence repeats)分子标记对其8个居群进行遗传多样性分析.在建立良好的反应体系基础上,从已有的阿月浑子SSR引物中筛选出9对适合进行黄连木遗传分析的引物,在8个黄连木居群中共检测到43条等位基因,位点平均等位基因数为4.78,平均多态位点百分率达90.28%.各居群内平均有效等位基因数为2.08,平均期望杂合度(He)为0.472,说明各居群的遗传多样性处于中等水平.按检测到的有效等位基因数(Ne)和期望杂合度(He),各居群的遗传多样性由高至低依次为安康唐县顺平辉县略阳栾川林州涉县.居群间的遗传分化系数(FST)平均为0.319,说明居群内变异是黄连木变异的主要来源,并根据遗传距离将8个居群分为三大类.     

肠道细菌乳糖酶基因多样性分析通用引物

为深入研究肠道细菌乳糖酶基因多样性,根据NCBI公布的细菌乳糖酶基因[Beta-galactosidase(lac Z)]序列,利用软件Primer Premier 5.0前后设计合成7对通用引物,经过PCR扩增、宏基因组测序和生物信息学分析进行引物筛选.PCR扩增电泳中,436R、375R、217R和406R四对引物没有扩增出目的片段,436、324和194三对引物均有目的条带扩出.内容物样品扩增,436引物条带最清晰,灵敏性高,324和194引物条带质量相差不大;粘膜样品扩增,324引物均扩增出目的条带,条带清晰明亮.436引物只扩增出一个样品的目的条带,灵敏度较差;194引物扩增杂带多,特异性差.样品序列统计方面,删除宿主序列信息后,内容物样品中,194、324和436三对引物最终序列比例均达98%以上;粘膜样品中,194引物特异性最差,436引物最好,324引物居中.OTU聚类和注释方面,内容物样品中,324引物扩增物种也较436引物多;粘膜样品中,324引物能聚类最多的物种.Alpha多样性方面,内容物样品中,324引物的Chao1、ACE、Simpson、Shannon指数较436引物大,436引物的Simpson、Shannon指数较194引物大;粘膜样品中,324引物的Chao1、ACE、Simpson、Shannon指数均较436引物大.综合分析,对肠道内容物和肠道粘膜细菌乳糖酶基因多样性研究选用324通用引物最佳.     

汕头海域几丁质酶产生菌的筛选及其几丁质酶编码基因研究

在汕头海域表层沉积物中分离得到69株高产几丁质酶的菌株,对其中6株形态特征差异比较明显、几丁质酶活力比较高的菌株SWCH-1、SWCH-2、SWCH-3、SWCH-5、SWCH-6和SWCH-9进行了16S rDNA序列鉴定,发现它们分别归属于5个属.即短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas).采用兼并引物对6株菌几丁质酶编码基因的催化保守区片段进行了PCR扩增和序列分析,发现菌株均含有18家族几丁质酶编码基因;但是其编码的蛋白序列与NCBI收录的蛋白序列存在着差异,其中菌株SWCH-1和SWCH-3的蛋白序列与数据库中序列的相似性比较低,分别为85%和81%,菌株含有比较新的几丁质酶编码基因,其全基因序列的克隆和酶蛋白的纯化分析尚在进一步研究中.图6参18     

浮萍转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为开发浮萍分子标记技术,采用高通量测序技术获得浮萍转录组原始实验数据,经过生物信息学软件Trinity拼接后,获得74 797条unigene.进一步采用生物信息学分析软件MISA对所有的unigene进行SSR位点数据挖掘.共计搜索出14 250个SSR位点,分布在12 707条unigene中,出现频率为19.05%,SSR平均长度为19 bp,平均分布频率是1/6.57 kb.在浮萍转录组的SSRs中,二核苷酸与三核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占总SSRs的70.74%和25.37%.浮萍转录组数据中SSR序列共包括185种重复基元类型,二核苷酸重复基元AG/CT和三核苷酸重复基元CCG/CGG是优势重复基元,分别占总SSRs的69.19%和8.84%.综上表明浮萍SSRs位点具有极大的可开发性.     

用SSR标记检测同源四倍体与二倍体水稻的遗传差异

随机选用分布于水稻(Oryza stativa L.)12条染色体上的15对SSR(simplej sequence repeats)引物，对18种中科院成都生物所培育的四倍体水稻和9种大面积种植的二倍体水稻进行了SSR多态性分析．11对具多态性的引物共检测到33条多态性条带，平均每对引物检测到3个等位基因．研究结果发现，所用同源四倍体水稻的基因组与二倍体水稻基因组大部分相同，只是在某些位点上具有差异，并筛选出部分SSR标记来区分二倍体与其同源四倍体．本研究还对二倍体与同源四倍体之间遗传差异的原因进行了初步的探讨．图2表2参12     

林木外生菌根真菌彩色豆马勃巢式PCR检测

为探讨林木外生菌根真菌的分子检测方法,利用真菌通用引物ITS1-F/ITS4-B扩增了外生菌根真菌彩色豆马勃的核糖体DNA内转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对彩色豆马勃特异性引物PtF/PtR.利用该对特异性引物与ITS1-F/ITS4-B组合进行巢式PCR,能从供试的彩色豆马勃10个菌株中特异性地扩增出1条347 bp的条带,而供试的其他6个参比菌株未出现扩增产物.经分析,该巢式PCR检测技术的灵敏度可达到10 fg的DNA,是常规PCR检测的1 000倍.利用该技术从马尾松苗木菌根中检测到目的外生菌根真菌.这表明采用本研究设计的特异性引物,利用巢式PCR技术可以灵敏、准确地从林木外生菌根中检测出彩色豆马勃.     

11个猕猴桃品种间的遗传多样性分析

利用随机扩增多态性DNA标记(RAPD)技术对采自四川省猕猴桃科研基地的11个猕猴桃品种进行了遗传多样性分析.通过引物筛选,从15个RAPD引物中扩增出135条带,其中100条为多态带,占74.07%.UPGMA聚类分析结果揭示了各品种间的亲缘关系.RAPD标记说明猕猴桃品种间遗传距离与地理分布有一定关系,地理位置较近的材料能聚在一起.分子标记可用于猕猴桃种质资源的分类、鉴定及良种选育.图2表2参15