玉米两个功能未知转录因子基因的转录后加工

ZmBH、ZmWD是玉米中分别具有转录因子bHLH和WD重复蛋白结构的两个功能未知基因,在不同组织中及各种胁迫诱导条件下,这两个基因均发生不同程度的剪接,产生大小各异的转录本.序列分析发现其剪接方式与经典的mRNA剪接不同,即剪接位点的选择不符合GT-AG或AT-AC规则,而是在剪接位点具有短正向重复序列SDR(Shortdirect repeats).ZmBH的转录后加工导致序列发生移码而提前终止,而ZmWD则缺失了大部分结构域序列,经由这种方式产生的转录后加工产物可影响蛋白编码,因而可能是对这两个基因功能进行调控的一种方式.图6表1参18     

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2 000 bp,大多数片段在400 bp和800 bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18 bD和右边界外234 bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.图2表2参24     

糯稻和非糯稻蜡质基因的新STS分子标记

通过对前人公布的糯性水稻蜡质基因全序列测定结果的分析,根据糯性水稻与非糯性水稻蜡质基因序列位点的差异,设计了两个基于PCR扩增反应的可特异识别糯性水稻的显性和共显性STS分子标记;同时在前人公布的非糯性水稻蜡质基因的不同类型(Wxa和Wxb)的全序列比对分析的基础上,选取了两种基因型特定的差异位点,设计了两个基于PCR扩增反应用于特异识别这两种Wx基因的显性STS分子标记,并用新建立的标记对相应的水稻基因型进行了检测.图2表2参10     

植物中3-磷酸甘油脱氢酶基因家族的物种特异性进化分析

3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是一种在磷酸甘油酯的代谢过程中起重要调节作用的关键酶,研究植物中3-磷酸甘油脱氢酶基因家族的进化历史及其多样性对进一步探索其作用机制具有重要意义.以20个已报道的GPDH基因作为查询序列,与19种代表性的植物物种的基因组分别进行BLASTP和t BLASTN比对以及隐马尔科夫模型搜索,获得基因家族新成员,构建系统发育树,并对其进行基因结构、蛋白模体、功能差异性以及适应性进化分析.预测得到了75个新的GPDH基因家族成员,系统发育分析表明,植物中的GPDH基因属于3个单系类群(命名为族群I、族群II和族群III),并且在进化过程中主要分为两个进化枝,说明GPDH基因家族源自两个GPDH祖先基因;功能差异性分析表明,氨基酸特异性位点的选择性约束作用于不同族群的GPDH基因上,并且导致了不同族群多样化之后的特异性进化,同时,在族群I/III和族群II/III中也发现了Type-II功能差异性,表明氨基酸的理化性质也发生了本质的改变;适应性进化分析以及ka/ks比值分析表明,GPDH基因家族在物种特异性复制之后的进化过程中受到了纯化选择作用.因此,GPDH基因家族在其进化过程中受到不同的选择压力而出现了不同的进化方向,形成了多样化的族群.此外,对该基因家族进行的系统的分子进化探索为植物中GPDH基因家族的进一步生物化学和遗传方面的研究以及基因组分析提供了数据基础,在GPDH基因家族分析中的结果与发现也为研究其他基因家族提供了有力的帮助.     

文心兰‘南茜’谷氧还蛋白基因克隆定位及表达

为研究文心兰谷氧还蛋白超家族基因ROXY在花药发育中的功能,以文心兰‘南茜’(Oncidium Gower Ramsey)为试验材料,从‘南茜’的转录组网站选取一条与拟南芥At ROXY1/2相似度最高的基因序列(命名为OnROXY1),以该序列的cDNA为模版设计引物,用RT-PCR从‘南茜’花器官中扩增该基因,并对扩增产物进行测序和保守结构域分析.结果表明,OnROXY1基因编码区402 bp,编码133个氨基酸,与‘南茜’转录组网站中的预测序列只有一个碱基差异,但与该预测序列的氨基酸序列和保守结构域完全一致(GenBank登录号:MF696154).OnROXY1基因具有典型的谷氧还蛋白(Glutaredoxin,GRX)基因家族的结构域和CMCC活性位点,因此该基因属于GRX基因家族,并且属于亚类CC型的GRX基因.进化树分析表明,OnROXY1与水稻的Os ROXY1、Os ROXY2和拟南芥的At ROXY1、At ROXY2蛋白序列的一致性最高,进化距离最近.亚细胞定位结果显示,OnROXY1主要定位于细胞核中,少量定位在细胞质中.RT-PCR检测发现,在不同组织部位中,OnROXY1在假鳞茎中的表达量最高,唇瓣中的表达量最低;不同花期的定量结果显示,OnROXY1在脱落干枯期时的表达量最高,盛开期时的表达量最低.本研究推测谷氧还蛋白基因OnROXY1可能在文心兰假鳞茎与根的发育、消除植物体内过多的活性氧以及延缓文心兰花器官的衰老等方面具有重要作用.     

小麦高分子量谷蛋白亚基基因的PCR及AS-PCR标记

选用高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)在Glu-D1位点已知的 26个普通小麦品种,包括 15个 (TriticumaestivumL. )川育系列品种及其 11个亲本,根据其亚基Dx5和Dy10基因的特异序列设计引物.通过对Dx5基因的PCR扩增及对Dy10基因的AS-PCR扩增,结果表明,所设计的引物对Dx5和Dy10都能扩增出特异条带,而携有Dx5基因的材料同时也携有Dy10基因.说明用所设计的引物可快速有效的鉴定出普通小麦中是否带有优质的 5 10亚基.图 4参 15     

黑斑蛙Dmrt1基因的克隆及在不同组织中的表达

Dmrt基因家族是新近发现的一个与性别决定相关的基因家族,该家族成员都含有一个新的具有DNA结合能力的保守基序——DM结构域.本文采用简并PCR技术,扩增并克隆了黑斑蛙基因组中的DM结构域,经序列分析,获得了Dmrt家族成员rnDmrt1;进一步根据获得的rnDmrt1序列,设计一对特异引物,采用RT-PCR技术对成蛙不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究.结果发现,rnDmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、脑、肝、心、肾及肌肉组织中无表达,显示Dmrt1基因在性别决定和分化中有重要功能. 图4参9     

多花黄精几丁质诱导赤霉素应答基因（CIGR）克隆及其功能

为探讨多花黄精几丁质诱导赤霉素应答基因(chitin-inducible gibberellin-responsive,CIGR)在不同光处理下的的作用机制,采用全长验证的方法获得多花黄精CIGR基因的cDNA序列、gDNA序列,并对其进行生物信息学分析,再对CIGR蛋白进行亚细胞定位观察,同时对不同光质和光周期处理下CIGR基因的表达模式进行分析.结果显示,多花黄精CIGR基因cDNA序列和gDNA全长序列一致,完整的开放阅读框(ORF)长度为1 770 bp,共编码589个氨基酸,CIGR基因无内含子结构.生物信息学分析表明CIGR具有一个GRAS结构域,属于GRAS家族,是植物特有的转录因子,为碱性蛋白,无信号肽;Motif分析表明,CIGR蛋白在物种间比较保守,保守区主要位于中部至3′末端;氨基酸序列进化分析表明,多花黄精与石刁柏的CIGR亲缘关系最近,同源性达81%.进一步亚细胞定位显示CIGR蛋白定位于细胞核,与预测结果一致.实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示,多花黄精CIGR基因具有器官表达特异性,在叶中表达量最高.在不同光质和光周期处理下,CIGR基因在蓝光下表达量较高,在远红光下表达量低;在光周期9 h/d的处理中出现峰值.本研究表明CIGR基因可能受蓝光及短光照周期调控从而影响多花黄精叶片的发育过程.(图9表1参49)     

深黄被孢霉苹果酸酶基因的克隆和表达

为了克隆与表达深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22苹果酸酶基因,根据深黄被孢霉M6-22转录组测序结果,以其c DNA为模板PCR扩增苹果酸酶基因编码序列,经测序验证分析后将扩增片段连接到表达载体pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET32a MIME2并进一步转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,经镍柱亲和纯化目的蛋白和酶活分析确定其为苹果酸酶.PCR扩增得到全长为1 815 bp的cDNA序列,序列分析表明该序列具有一个编码604个氨基酸的开放阅读框,预测编码蛋白分子量(Mr)为66.4×10~3.预测的氨基酸序列与已报道的苹果酸酶同样具有保守的2个二核苷酸结合结构域和1个二价金属离子结合结构域,因此是一个新的苹果酸酶基因序列,命名为MIME2,Gen Bank序列号为KU097323.将该序列转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测到1条约67×10~3的蛋白条带表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱氢生成丙酮酸,同时生成NADPH,具有苹果酸酶的特性,其酶活大小为177.46 U/mg.以上结果证明所克隆的cDNA序列MIME2为1个新的苹果酸酶基因,基因编码蛋白具有苹果酸酶活性,可为深入研究苹果酸酶的结构和功能关系以及进一步应用奠定基础.     

家蚕丝心蛋白轻链cDNA和基因调控片段的克隆及序列分析

从家蚕品种菁松×皓月后部丝腺中提取总RNA ,用RT -PCR扩增技术克隆到家蚕丝心蛋白轻链cDNA .序列分析表明 ,该片段全长为 798个碱基 .比较 4种不同品种来源的家蚕丝心蛋白轻链基因外显子区域序列 ,同源性在98.0 %～ 99.4 %之间 ,推测的氨基酸同源性在 98.0 %～ 99.6 %之间 ,4个品种间发生的变异比较一致地集中在不同位置的 8个碱基上 .提取家蚕品种菁松×皓月后部丝腺总DNA ,进行PCR反应 ,获得家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段 ,长度约为 1.2kb,测定了其邻近起始密码子一端包括 5 76个碱基的DNA序列 .结果表明 ,该片段包括一些典型的调控元件和多个可能参与丝蛋白基因特异性表达调控的元件 ,该部分序列与J - 139L链基因相应区域同源性高达 98.8% .图 3参 8     

水稻RBX1基因cDNA的分离及其过量表达载体对水稻的转化

RBX1蛋白是基于Cullin蛋白的E3复合体中的一个亚基,对于基于Cullin蛋白的E3复合体结合E2及Cullin蛋白的活化具有重要作用.利用RT-PCR分离到水稻RBX1cDNA,序列比对分析显示,水稻RBX1与拟南芥、人、果蝇及酵母中该同源蛋白的氨基酸序列一致性分别为80%、74.4%、72%和51.2%.酵母双杂交实验显示,水稻RBX1与水稻Cullin4蛋白有着相互作用.将水稻RBX1cDNA插入植物表达质粒pHB,利用农杆菌介导法将构建好的植物表达载体导入水稻,获得植株38株.以基因组DNA为模板对潮霉素抗性基因片段进行扩增,初步确定其中32株为转基因植株.图5表1参17     

油松叶绿体DNA间隔序列特点及系统学意义

对全国分布区12个天然油松种群进行取样,测定了叶绿体DNAtrnT-trnL、trnS-trnG、trnL-trnF基因间隔序列,分析了序列碱基组成特点及在松科系统分类中的意义.测序结果显示,3个片段碱基序列均富含A/T,长度依次为448bp、636bp和421bp,所测片段在种群水平上十分保守,没有发现具有种内鉴别意义的碱基变异.但此片段适合于松科属间和种间的系统学分析,运用PHYLIP软件构建松科植物的邻接系统树,支持松科分为两个亚科的分类系统,拓扑结构表明松属与银杉属的关系最近.由于叶绿体DNA序列长度适中,扩增和测序较为容易,适合作为研究松科植物系统进化较为理想的分子标记.图2表2参24     

马铃薯X病毒山西分离物外壳蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

对GenBank公布的马铃薯X病毒的基因组核苷酸序列和外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了同源性比对分析.结果表明,马铃薯X病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的同源性要高于基因组全序列的同源性,并且外壳蛋白基因3'端核苷酸序列的同源性又高于5'端.设计一对特异性引物,以马铃薯感病植株的总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到了马铃薯X病毒外壳蛋白基因.该基因含714个核苷酸,编码238个氨基酸.核苷酸序列比对结果表明,该基因与Genbank公布的马铃薯X病毒其他分离物的外壳蛋白基因的同源性为80.2%～97.5%,且3'端的同源性要高于5'端.上述结果预示,RNA干扰抗病毒基因工程中,利用马铃薯X病毒外壳蛋白基因的3'端比用5'端是更好的策略.     

籽粒苋苹果酸酶(NAD-ME)基因密码子偏好性分析

遗传密码子是生命信息的基本遗传单位,每种氨基酸对应1～6个同义密码子.特定物种在长期进化中形成了适应自身基因组环境的密码子使用偏性.运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析自主克隆的籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性,并与马铃薯等7种植物的ME基因密码子偏好性进行比较,以期为该基因在作物遗传改良中选择合适的受体植物提供依据.结果表明,籽粒苋NAD-ME基因偏好于以A或T结尾的密码子,其它几种被比较作物的ME基因也有同样的趋势,但双子叶植物的偏好性更强.基于NAD-ME基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,籽粒苋与马铃薯、拟南芥、葡萄、蓖麻、毛果杨等双子叶植物聚为1类,玉米和高粱这2个单子叶植物聚为1类,预示籽粒苋NAD-ME基因更适合导入马铃薯等双子叶植物.对籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性与大肠杆菌和酵母的基因组密码子偏好性进行比较,发现均存在差异,与大肠杆菌的差异高于酵母,表明酵母表达系统要优于大肠杆菌表达系统.若要进一步提高籽粒苋NAD-ME基因在大肠杆菌或酵母中的表达水平,尚需对其密码子进行优化.     

Ralstonia eutropha菌株镉抗性调节基因CzcR的克隆与序列测定

G-细菌镉抗性决定子是一个编码4个蛋白的CzcCBAD操纵子,参照GenBank已登录Czc基因序列进行引物设计,利用PCR技术,从可在含350mg/LCdCl2的培养基上生长的抗镉菌株Ralstoniaeutropha质粒中,扩增出长度约为1200bp的革兰氏阴性细菌镉抗性系统中的抗性调节基因CzcR,然后将其亚克隆到pGEM-T-easy载体上,并转化至受体菌中,构建重组质粒,采用碱性裂解法提取质粒DNA后,经EcoRI酶切分析和核苷酸序列分析,其与GenBank中登录的CzcR基因序列相似性高达98%,显示其具有正确的CzcR基因核苷酸序列。镉抗性基因的获得将大大推动对微生物抗重金属机理的研究,并为进一步构建耐镉基因工程菌,高效净化重金属污染环境打下坚实的基础。     

甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆

促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一是蔗糖合成酶,它也是蔗糖代谢关键酶中极其重要的一种酶.以甘蔗基因组DNA为模板,用PCR技术分段扩增并克隆了甘蔗蔗糖合成酶(Sucrose synthase)基因片段,并进行序列测序,表明该基因全长约为7.5 kb,与Lingle S.E等报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.5%,推导的氨基酸序列同源性达到100%.该序列包含约1.9 kb的上游启动子调控区域, 16个外显子, 15个内含子, 3'不翻译区等,开放读码框(ORF)编码802个氨基酸,氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr,为进一步在转录水平上阐明蔗糖合成酶的表达调控机制奠定了基础.     

甘蔗泛素结合酶基因的克隆与表达

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因(Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme,ScUBc E2)并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用,选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库(Suppression subtractive hybridization,SSH)中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针,结合电子克隆技术和RT-PCR技术,以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因(ScUBc E2;Gen Bank accession number:KJ577594.1),该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框,编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示,ScUBc E2编码的蛋白分子量(Mr)为16.507×10~3;无信号肽,为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点,74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,ScUBc E2基因组成型表达,但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制,在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制,后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达,对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明,甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式,可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程,有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时,该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式,可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.     

中华猕猴桃EIN3/EIL转录因子家族的成员鉴定、系统进化和基因表达模式

EIN3/EIL家族是一类非常重要的转录因子,调控植物包括果实成熟在内的众多生长发育过程.对中华猕猴桃EIN3/EIL家族进行系统的生物信息学和比较基因组学研究,在中华猕猴桃基因组中鉴定得到8个EIN3/EIL转录因子;其蛋白序列包括1个酸性氨基酸富集区、1个脯氨酸富集区以及5-7个碱性氨基酸富集区.包括中华猕猴桃在内的20种植物的EIN3/EIL成员的系统进化树表明,EIN3/EIL基因在众多植物基因组中同时存在趋同和趋异的进化趋势.中华猕猴桃EIN3/EIL基因家族成员的增加主要源于其进化过程中发生的全基因组三倍化倍增事件.在果实成熟过程中,中华猕猴桃EIN3/EIL基因呈现组成型的高或低表达两种截然相反的基因表达趋势.本研究鉴定得到了中华猕猴桃EIN3/EIL家族的成员,系统揭示了其成员蛋白序列中的保守区域、在不同植物物种中的进化趋势,植物基因组倍增所导致的家族成员增加,以及果实发育过程中表现出的显著的基因表达水平差异,可为中华猕猴桃EIN3/EIL基因的功能研究提供候选基因以及数据基础.     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

人类转录因子样新基因TFL76的初步研究

运用基于基因组数据库特定基因同源基因的克隆策略得到人类新基因TFL76 ,它编码 12个C2 H2 型锌指基序 .其cDNA序列长 2 2 6 8bp,预测的编码蛋白含 6 77个氨基酸 ,分子量 (Mr)为 76× 10 3 .生物信息学分析表明 ,TFL76的N末端含有多种蛋白激酶的磷酸化位点和核定位信号 ,具有转录因子的特征 .染色体定位为 19q13.4 ,此位点存在很多与癌症相关的基因 .对 9.5d和 10 .5d的鼠胚进行全胚原位杂交 ,结果表明 ,此基因在前肢芽和后肢芽表达较高 .图 5表 1参 5