粘红酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ12-脂肪酸脱氢酶一般特异性催化在油酸的Δ12位引入双键转变成亚油酸.为了从粘红酵母YM25079中克隆全长Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列,参考已知的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增获得到全长为1 353 bp的c DNA序列,序列分析结果表明该序列具有一个编码450个氨基酸的完整开放阅读框,所编码蛋白质的大小为50.9×103.与报道的Δ12-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ12-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证其功能,把开放阅读框序列亚克隆到表达载体p YES3/CT,构建重组表达载体p YRGD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达.脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,该序列所编码的蛋白质具有Δ12-脂肪酸脱氢酶活性,能将油酸转化为亚油酸,亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的4.31%.以上结果表明,PCR所获得序列是新的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因.     

Sch9蛋白激酶调控酵母细胞全蛋白的泛素化

为探讨蛋白激酶Sch9是否影响细胞蛋白质稳态水平及其在热胁迫时的响应,以野生型、SCH9基因缺失突变体、转sch9基因ΔSch9(SCH9-3HA)酵母为材料,利用特异的泛素抗体,检测长期培养时全蛋白泛素化水平变化.结果表明,Sch9缺失引起细胞全蛋白泛素化水平降低,转sch9基因可以使细胞全蛋白泛素化水平恢复.55℃热胁迫30 min处理,突变体Δsch9全蛋白泛素化水平降低,转sch9基因Δsch9(SCH9-3HA)全蛋白泛素化水平不变,回到正常生长温度时,蛋白泛素化水平也没有改变.外加蛋白酶体抑制剂MG132时,突变体ΔSch9蛋白泛素化水平不受影响,而转sch9基因△sch9(SCH9-3HA)全蛋白泛素化水平显著增加,表明前者是自噬途径降解,而增加部分是通过蛋白酶体途径降解.蛋白激酶Sch9调控细胞全蛋白泛素化水平,以及2个不同的降解途径.     

非生物胁迫诱导青蒿素生物合成基因的表达

对离体培养青蒿试管苗中3个青蒿素合成相关基因的非生物胁迫诱导表达模式进行了初步研究.半定量RT-PCR测定结果表明,当暴露于冷、热和紫外光后,青篙植株的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)和细胞色素P450单加氧酶基因(CYP71AV1)转录上调;相反,在未经胁迫处理的情况下,ADS和CYP71AV1基因的表达水平较低,而在胁迫处理前后细胞色素P450还原酶基因(CPR)转录所产生的mRNA均保持恒定.同时,冷胁迫的诱导效果也得到实时荧光定量RT-PCR测定数据的支持.经低温锻炼的青蒿试管苗,其ADS和CYP71AV1基因的转录产物拷贝数比对照分别提高11倍和7倍,而CPR基因的mRNA拷贝数与对照基本持平.短暂预冷处理还可显著提高青蒿试管苗的青蒿素含量,达到7.5～8.8 mg/g干重,比对照提高66.7%～95.6%,为进一步探索利用环境胁迫促进青蒿素高产的新途径提供了可能性.图2表3参21     

高羊茅中一个DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析

为了鉴定草坪草高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)中与低温、高盐和干旱胁迫相关的基因,我们构建了冷诱导(4℃)的高羊茅cDNA文库,并从这个文库中分离得到一个DREB类转录因子基因,FaDREB1A.序列分析表明,FaDREB1A具有一个717bp的开放阅读框和143bp的3’非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的EREBP/AP2结构域.酵母单杂交结果表明,FaDREB1A蛋白能在体外特异结合DRE元件,并具有转录激活功能.Southern杂交结果显示,FaDREB1A在高羊茅基因组中可能是单拷贝或低拷贝基因.Northern杂交结果发现,FaDREB1A基因受低温、高盐和干旱的诱导表达,对ABA没有反应,说明FaDREB1A基因在高羊茅植株对低温、高盐和干旱的应答反应中起重要作用.图5参30     

不同光质对衣藻（Chlamydomonas sp.212）生长及油脂积累的影响

研究白光、红光、蓝光、红蓝光(1:3)、红蓝光(1:2)、红蓝光(1:1)、红蓝光(2:1)和红蓝光(3:1)8种光质在100μmol m-2 s-1的光照强度下对Chlamydomonas sp. 212生长特性及油脂积累的影响.在不同光质条件下进行Chlamydomonas sp. 212的培养,对其生物量、光合色素含量、碳水化合物含量、蛋白质含量、油脂积累量及脂肪酸组成等指标进行测量与综合分析.结果发现,蓝光下Chlamydomonas sp. 212的生物量达到最大(0.335 1 g/L),红光下其生物量最小.蓝光下Chlamydomonas sp. 212的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均为最高,分别为12.26、6.34和5.94 mg/L;红光下叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均较低.Chlamydomonas sp. 212在红光下碳水化合物的含量最高(27.54%),蛋白质的含量最低(23.68%);蓝光下碳水化合物的含量最低(19.12%),蛋白质的含量为31.46%;红蓝光下碳水化合物和蛋白质的含量低于白光. Chlamydomonas sp. 212在蓝光下油脂含量为29.86%,产量为100.06mg/L;红光下油脂含量为27.52%,油脂产量最低;而红蓝光下油脂的积累量明显升高,红蓝光(1:2)下油脂含量最高35.25%,红蓝光(1:3)下油脂产量最高(109.23 mg/L).不同光质对Chlamydomonas sp. 212脂肪酸组成的影响不显著,C16和C18脂肪酸的相对含量达到93%以上,饱和脂肪酸约占47%,不饱和脂肪酸约占53%.本研究表明蓝光有利于Chlamydomonas sp. 212的生长,红光不利于其生长;蓝光有利于油脂的积累,红蓝光下油脂的积累显著升高,且蓝光占比越高,越有利于油脂的积累,红蓝光(1:3)下油脂的积累量最高;结果可为不同光质在微藻生产生物柴油中的应用提供理论依据.(图6表1参32)     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析

通过对野生克雷伯氏菌(Klebsiella)进行紫外诱变,获得一株耐高浓度甘油及高浓度1,3-丙二醇的突变菌株A-39-3,该突变株产1,3-丙二醇的量较野生菌株提高了58%,副产物2,3-丁二醇和乙醇的量分别降低了27%和19%.为探讨突变株高产1,3-丙二醇的原因,通过对突变菌株发酵过程中关键酶的酶活跟踪分析,发现1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力与野生菌株相差不大,甘油脱氢酶(GDH)的酶活力略有下降,而突变菌株的甘油脱水酶(GDHt)的酶活力明显高于野生菌株.并采用半定量RT-PCR方法,从转录水平上比较甘油脱水酶基因的差异,结果发现突变菌株A-39-3甘油脱水酶基因的相对mRNA转录水平是野生菌株K的2.58倍,分析说明该突变株1,3-丙二醇产量的提高与关键酶基因dhaB的mRNA转录水平关系密切.     

2株石油降解菌生长和降解石油条件的优化

对2株石油降解菌DH-5和DH-9生长的最适培养基成分以及降解石油的最佳环境条件进行了筛选。结果表明,DH-5的最佳培养基成分为ρ(原油)1 g.L-1、ρ(氮源)400 mg.L-1、ρ(磷源)200 mg.L-1、ρ(酵母浸出液)20 mg.L-1,最有效利用的氨基酸为精氨酸,最适环境条件为pH 7.0、盐度20、温度15～30℃;DH-9的最佳培养基成分为ρ(原油)1 g.L-1、ρ(氮源)400 mg.L-1、ρ(磷源)100 mg.L-1、ρ(酵母浸出液)20 mg.L-1,最有效利用的氨基酸为天冬氨酸,最适环境条件为pH 7.5、盐度20、温度30℃。当ρ(原油)为20 g.L-1时,DH-9的生物量和原油降解率分别是DH-5的2.58倍和2.29倍。研究表明,DH-9对高浓度原油的耐受性明显强于DH-5,而DH-5对低温的适应性优于DH-9,2个菌株对高盐度的适应性均较强。     

低温对高产杂交稻抽穗期剑叶光合色素含量和抗氧化酶活性的影响

以高产杂交稻“两优培九”和常规杂交稻“汕优63”为试验材料,采用15和20℃处理2和4 d,比较低温对水稻抽穗期剑叶光合色素含量和抗氧化酶活性的影响。结果表明:低温下抽穗期水稻剑叶光合色素(叶绿素、类胡萝卜素)含量随处理时间延长而下降,抗氧化酶CAT活性下降,SOD、POD活性变化存在品种间差异。低温处理4 d后,“两优培九”SOD活性上升,POD活性降低,“汕优63”变化则相反。抗氧化酶之间活性变化的不平衡,使活性氧的产生与清除失衡,O2-迅速积累,膜脂过氧化加剧,MDA含量上升。这些变化导致水稻剑叶净光合速率在低温下降低。试验结果表明,高产杂交稻“两优培九”比常规杂交稻“汕优63”对低温的适应能力更强。     

响应面法优化固定粘红酵母细胞条件及生物转化制L-苯丙氨酸

采用响应面分析法对影响粘红酵母细胞固定化的4个主要因素——单体浓度、交联剂浓度、包埋量、包埋时间进行了优化.首先用Plackett-Burman法设计实验对以上4个影响因素进行了评价,并筛选出显著影响因素——单体浓度和包埋量;第2步用最陡爬坡实验逼近以上两因素最优水平;最后由中心复合实验及响应面分析确定主要影响因素的最佳条件.固定化粘红酵母细胞的最优包埋条件为:单体浓度16.7%,包埋量43%,交联剂浓度2.0%,包埋时间45min.在此条件下得到的固定化细胞与游离细胞相比,酶活保留率可达63%,较优化前提高了31%.实验室制备试验中L-苯丙氨酸(L-Phe)积累浓度可达53.3g/L,与该菌株的中试游离整细胞一次批式转化产L-Phe浓度30g/L比较,产率提高了1.8倍.图3表9参15     

拟南芥硫酯酶基因(atfata)在大肠杆菌中的表达及其对游离脂肪酸合成的影响

硫酯酶催化脂酰ACP(酰基载体蛋白)水解生成游离脂肪酸和ACP载体蛋白,能够解除脂肪酸合成与磷脂合成的偶联,是获得游离脂肪酸的关键基因.将拟南芥的硫酯酶基因atfata克隆到原核表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了His-tag融合蛋白,经SDS-PAGE检测获得特异性表达条带.对该重组菌株进行摇瓶发酵实验,GC-MS检测表明其与对照菌株脂肪酸组成并未发生变化;但其脂肪酸产量达到232.06 mg/L,比对照菌株提高了70%;同时胞外游离脂肪酸产量达到了33 mg/L,占总脂肪酸含量的15%,是野生菌株胞外脂肪酸产量的7倍.图3表2参17     

鼠李糖脂对东海典型甲藻赤潮生物生长抑制作用的影响

探讨了铜绿假单胞菌产鼠李糖脂类生物表面活性剂对东海典型甲藻赤潮生物锥状斯式藻(Scrippsiella trochoidea)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海洋原甲藻(Prococentrum marinum)和微小原甲藻(P.minium)生长的抑制作用,并对其不同抑制作用的机理进行了初步探讨.结果表明,鼠李糖脂在一定浓度范围内对几种甲藻的生长表现出明显的抑制作用,对几种甲藻生长抑制作用的强弱顺序为:锥状斯式藻>微小原甲藻>塔玛亚历山大藻>海洋原甲藻.对不同属的甲藻,这种抑制作用可能与藻细胞本身表面的附属物、内部物质组成及个体大小有关;而对于同一属的甲藻则与各甲藻的生物膜脂肪酸组成尤其是其多不饱和脂肪酸的含量有关,即甲藻的多不饱和脂肪酸含量越低,鼠李糖脂对藻细胞生长的抑制作用越明显,反之亦然.图1表2参18     

低温弱光条件下毒死蜱对黄瓜的毒性效应及油菜素内酯的调控作用

农药在使用中可能对农作物产生药害作用,而在低温弱光的亚适宜条件下,设施作物对农药暴露的应激响应可能具有特殊性。同时,作为一种新型植物激素,油菜素内酯在亚适宜条件下是否能够缓解农药的药害作用的研究有限。以典型的设施作物黄瓜为受试生物,通过人工气候箱模拟低温弱光的亚适宜条件,在毒死蜱(浓度分别为0.3和1mmol·L-1)暴露1、3和7d后,以实时荧光定量PCR对黄瓜叶片中光合作用基因(psaB、psbA和rbcL)、抗氧化系统相关基因(cAPX、DHAR、GR、CAT和GPX)、防御和应激相关基因(PAL、HPL、ADC和HSP70)的转录水平进行检测,阐明其毒性效应。并对比24-表油菜素内酯的预处理组,探讨油菜素内酯如何调控作物对农药胁迫的响应。结果表明,在低温弱光条件下,毒死蜱暴露抑制了黄瓜叶片中上述大部分基因的转录,而24-表油菜素内酯预处理后其转录水平显著上升,表明24-表油菜素内酯可有效且持续地缓解毒死蜱的药害效应。     

富油小球藻Chlorella protothecoides胞内多糖和油脂提取工艺优化

对小球藻(Chlorella protothecoides)胞内多糖和油脂的提取工艺进行优化,旨在最大程度地提高其高价值代谢产物的综合利用价值.结果显示,在先提取小球藻胞内多糖、后提取油脂的情况下,不仅胞内多糖可以得到充分的提取,油脂的损失量也很小.当提取介质的pH为14时,胞内多糖提取量最高,剩余的油脂含量也最高,油脂损失最少.对胞内多糖提取条件进行正交优化,料液比为主要影响因素,超声时间、提取时间和提取温度为次要因素,最佳工艺条件为:料液比1:25(m/V),超声时间20 min,提取时间180 min,提取温度70℃.在此条件下得到的胞内多糖含量为4.72%,剩余的油脂含量为41.18%.胞内多糖提取前后小球藻的脂肪酸组成基本上没有变化.小球藻的脂肪酸组成主要为C16和C18,不饱和脂肪酸含量丰富,占总脂肪酸含量的80%以上.图2表5参21     

模拟酸雨对葡萄叶片和花粉的影响

以巨峰葡萄为试材,研究了模拟酸雨对叶片和花粉的影响,结果表明：（１） 经ｐＨ２ ．５ 和ｐＨ２ ．０ 的酸雨处理后叶片在短期内均出现不同程度的可见性受害伤斑,叶绿素含量和净光合速率下降．（２） 酸雨使叶片ＳＯＤ活性及不饱和脂肪酸指数（ＩＵＦＡ）下降,膜脂过氧化产物ＭＤＡ 含量及细胞膜透性显著增加,并且这些指标的变化与酸雨ｐＨ值有显著的相关性．（３）叶片对酸雨处理引起的生理伤害有一定的自我修复功能．（４） 酸雨对叶片的生长和花粉发芽有明显的抑制作用     

表达外源DsCOR转基因拟南芥的筛选及其抗寒性

为验证播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能,在实验室前期DsCOR基因大量研究的基础上,本研究通过农杆菌介导花序浸染法把诱导型表达载体PBI121-DsCORpro681-DsCOR转入COR15a缺陷型拟南芥中(A-S),筛选获得转DsCOR基因阳性苗(A-I),并测定了A-I、A-S和野生型(A-W)拟南芥在4℃低温胁迫下的叶片脯氨酸含量、电解质渗透率和幼苗在-4℃下存活率等抗寒生理指标;使用Real-time quantitative RT-PCR检测A-I在低温胁迫下DsCOR基因的表达规律.结果显示,A-W和A-I两种植株叶片脯氨酸含量在低温处理过程中显著增加,从处理前70μg g~(-1)到处理后12h分别升至453μg g~(-1)和406μg g~(-1)并趋于稳定,A-S叶片脯氨酸含量变化不大(30~(-1)05μg g~(-1)).随着处理时间增加,A-S叶片电解质渗透率升高较明显,36 h后达到45.2%;而A-W和A-I两种植株叶片电解质渗透率最高分别达到14.3%和16.3%.幼苗存活率统计结果显示,A-S缺失COR15a后,在-4℃处理后该株系幼苗全部死亡,而A-W和A-I两个株系都有较高的存活率,分别达到53%和83%.抗寒生理指标结果表明转DsCOR基因拟南芥的抗寒能力已得到显著提高,达到野生型拟南芥水平.Real-time quantitative RT-PCR检测显示DsCOR基因在A-I中表达明显受到低温胁迫诱导.综上,DsCOR基因在COR15a缺陷型拟南芥中实现了成功表达,并显著提高了其抗寒性,最终验证了播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能.     

水杨酸对小麦高盐毒害的缓解作用

以盐敏感品种中国春、农大８５０２１和抗盐品种冬６８、茶淀红等４个品种小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）为材料,研究盐分胁迫对小麦种子萌发和幼苗生长的影响以及水杨酸对盐害的缓解作用．结果表明,水杨酸能够相对提高盐分胁迫条件下小麦种子萌发的数量、速度和质量;提高幼苗根和叶内游离脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的含量,增强其渗透调节能力,同时提高幼苗体内超氧化物歧化酶、过氧化物酶等细胞保护酶的活性,抑制膜脂过氧化作用产物丙二醛的积累,降低叶片质膜透性和盐分胁迫对细胞膜的伤害．所有这些变化都有利于缓解盐害,提高小麦抗盐性     

冷应激对断乳仔猪ACTH及皮质醇的影响

断乳仔猪在-3~3℃低温条件下冷暴露24h,然后在15~18℃室温条件下恢复,检测血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇的动态变化.结果表明,仔猪血浆中ACTH和皮质醇含量随冷暴露时间延长而逐渐升高,冷应激6h时,ACTH含量高于冷应激前的水平(P<0.05);冷应激12h时,ACTH和皮质醇含量与冷应激前比较均有极显著升高(P<0.01);冷应激24h时,两激素含量与冷应激前无显著差异.终止冷暴露后0.5h,ACTH和皮质醇含量均高于冷应激前水平(P<0.05,P<0.01);3h时两激素水平基本恢复正常,但6h时两激素水平再次升高(P<0.01),呈波动性变化.表1参10     

十二烷基苯磺酸钠暴露对黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胚胎发育毒性和仔鱼神经毒性的影响

该研究旨在探明十二烷基苯磺酸钠(SDBS)对黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胚胎发育毒性和仔鱼神经毒性的影响,科学评估水体中SDBS污染的环境生态风险。将受精后4 h的黄颡鱼胚胎暴露于质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L^-1的SDBS中,观察胚胎孵化累计死亡率、畸形率;并通过检测5日龄仔鱼脑组织中乙酰胆碱酯酶活性及相关基因的转录水平、5-羟色胺及相关基因的转录水平,探讨其神经毒性的潜在机制。结果显示,与对照相比,暴露处理的黄颡鱼胚胎孵化畸形率提高4.5～14.5百分点(P<0.05),死亡率提高7.8～23.4百分点(P<0.05)。与对照相比,暴露处理正常仔鱼和畸形仔鱼的乙酰胆碱酯酶活性分别显著降低12.0%～50.5%和15.0%～53.9%(P<0.05),暴露处理仔鱼乙酰胆碱酯酶基因mRNA转录水平下降;暴露处理正常仔鱼和畸形仔鱼5-羟色胺含量分别显著降低2.6%～9.9%和3.0%～11.1%(P<0.05),暴露处理仔鱼5-羟色胺基因的转录水平降低。上述结果表明,十二烷基苯磺酸钠暴露显著...     

生长温度对盾叶薯蓣POD活性等生理特性的影响

研究了15℃、20℃、25℃、30℃和35℃五个不同温度条件下盾叶薯蓣一些生理参数的变化.结果显示,盾叶薯蓣叶片的POD活性和MDA含量的变化呈V字形,其中在25℃时处于最低点;可溶性蛋白含量的变化呈M字形,可溶糖含量的变化呈W字形.在15℃、20℃、30℃和35℃下, 5d内,随着时间的延长,MDA含量增加,POD活性、可溶性蛋白和可溶性糖的含量下降;在25℃下,盾叶薯蓣的POD活性以及MDA、可溶性蛋白和可溶性糖的含量变化较小,相对稳定,所以25℃是最为适宜的生长温度. 图1表1参20     

三苯基锡对假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的生长抑制及温度的影响

在我国近岸海域环境中,三苯基锡分布十分广泛。本研究以假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)为目标物种,研究了4个不同温度条件下(10℃、15℃、25℃与30℃)三苯基锡暴露对其细胞生长以及光合作用参数(Fv/Fm与ФII)的影响。结果表明,假微型海链藻的细胞生长速率在高温与低温条件下均显著下降,而光合作用参数仅在30℃条件下受到显著影响。在暴露温度为10℃、15℃、25℃与30℃时,三苯基锡(triphenyltin,TPT)对假微型海链藻的生长抑制IC50值分别为1.81、1.69、1.09与0.73μg·L-1。TPT对假微型海链藻光合作用抑制的IC50随着温度的升高呈降低趋势。Two-way ANOVA分析结果显示,温度与三苯基锡的相互作用显著影响假微型海链藻的光合作用。上述研究结果可以为了解不同温度下三苯基锡对海洋微藻的毒性效应提供科学依据。