人类转录因子样新基因TFL76的初步研究

运用基于基因组数据库特定基因同源基因的克隆策略得到人类新基因TFL76 ,它编码 12个C2 H2 型锌指基序 .其cDNA序列长 2 2 6 8bp,预测的编码蛋白含 6 77个氨基酸 ,分子量 (Mr)为 76× 10 3 .生物信息学分析表明 ,TFL76的N末端含有多种蛋白激酶的磷酸化位点和核定位信号 ,具有转录因子的特征 .染色体定位为 19q13.4 ,此位点存在很多与癌症相关的基因 .对 9.5d和 10 .5d的鼠胚进行全胚原位杂交 ,结果表明 ,此基因在前肢芽和后肢芽表达较高 .图 5表 1参 5     

褐牙鲆白化相关基因zfp123的组织表达谱与蛋白结构分析

C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体.对通过mRNA差异显示技术和克隆测序.在褐牙鲆中获得的一条白化相关锌指蛋白基因zfp123,进行了电子表达谱与实验验证表达谱的比较分析及该蛋白序列的一、二级和三级结构分析.电子表达谱分析分别对与ZFP123有较高同源性的斑马鱼、家鼠和猪的zfnd5a(zfp123)摹因各个组织表达情况进行了比较分析;一、二级结构分析发现其具有多个保守的基序和结构域;同源建模显示其具有一个"C-X(2-4)-CX11-C-X2-C"结构的锌指样三级结构.ZFP可以介导靶基因的转录调控,抑制或激活特定基因的表达;对DNA进行修饰,如人造限制性内切酶、重组酶、抗病毒感染等.锌指蛋白应用前景广阔.研究价值显著,是未来基因治疗的革命性的工具.     

过量表达SlWD6基因增强番茄抗旱和耐盐功能

WD40蛋白广泛存在于真核生物体内,在生物体内协助细胞行使多种功能,目前关于WD40蛋白的研究多集中在拟南芥菜和水稻中.生物信息学分析显示,Sl WD6蛋白包含两个保守的WD-repeat结构域,属于WD40家族.为了解番茄中Sl WD6基因的功能,采用RT-PCR方法检测番茄的根、茎、叶、花和不同发育时期果实中Sl WD6基因表达量.利用RT-PCR方法获得Sl WD6基因全长,并且构建Sl WD6过量表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,利用Realtime PCR检测3个独立的转基因株系(WD6-393、WD6-418和WD6-421)中Sl WD6基因的表达量,并进行耐盐和抗旱性分析.结果显示,番茄Sl WD6基因为组成型表达,果实各时期表达量较高,在红果时期表达量达到最高;转基因株系中Sl WD6基因的表达量显著高于野生型;在干旱和高盐胁迫下,转基因植株叶片脯氨酸(Pro)含量显著高于野生型,丙二醛(MDA)含量与野生型相比则显著降低.用Na Cl和甘露醇介导耐盐和干旱胁迫,Sl WD6转基因植株T2代种子的根长和苗长显著高于野生型植株.综上,Sl WD6基因的过量表达能够显著增强番茄的抗旱和耐盐功能.     

褐牙鲆白化相关基Nzfp123的组织表达谱与蛋白结构分析

C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体．对通过mRNA差异显示技术和克隆测序，在褐牙鲆中获得的一条白化相关锌指蛋白基因zfp123，进行了电子表达谱与实验验证表达谱的比较分析及该蛋白序列的一、二级和三级结构分析．电子表达谱分析分别对与ZFP123有较高同源性的斑马鱼、家鼠和猪的zfand5a（zfp123）基因各个组织表达情况进行了比较分析；一、二级结构分析发现其具有多个保守的基序和结构域；同源建模显示其具有一个“C-X（2-4）、-C-X11-C-X2-C”结构的锌指样三级结构．ZFP可以介导靶基因的转录调控，抑制或激活特定基因的表达；对DNA进行修饰，如人造限制性内切酶、重组酶、抗病毒感染等．锌指蛋白应用前景广阔，研究价值显著，是未来基因治疗的革命性的工具．图2表1参21     

水稻RBX1基因cDNA的分离及其过量表达载体对水稻的转化

RBX1蛋白是基于Cullin蛋白的E3复合体中的一个亚基,对于基于Cullin蛋白的E3复合体结合E2及Cullin蛋白的活化具有重要作用.利用RT-PCR分离到水稻RBX1cDNA,序列比对分析显示,水稻RBX1与拟南芥、人、果蝇及酵母中该同源蛋白的氨基酸序列一致性分别为80%、74.4%、72%和51.2%.酵母双杂交实验显示,水稻RBX1与水稻Cullin4蛋白有着相互作用.将水稻RBX1cDNA插入植物表达质粒pHB,利用农杆菌介导法将构建好的植物表达载体导入水稻,获得植株38株.以基因组DNA为模板对潮霉素抗性基因片段进行扩增,初步确定其中32株为转基因植株.图5表1参17     

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.     

水稻DDB1基因的表达特性及功能分析

利用RNA干涉技术构建水稻DDB1(Damaged DNA binding protein 1)基因不同启动子驱动植物表达载体,DDB1-RNAi和DDB1-glu-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入水稻愈伤,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,与野生型植株相比,两组转基因植株幼叶内DDB1的表达量...     

番茄HP1和HP2基因RNA共干涉载体的构建及遗传转化

番茄HP1和HP2是色素积累的负调控因子,在光形态建成和色素积累调控中起着重要作用.将番茄HP1、HP2基因片段导入到植物表达载体pBI121,用番茄果实特异表达的TMF7基因的启动子替换原有的CaMV 35S启动子,构建果实特异表达HP1、HP2双基因RNA共干涉植物表达载体pBI121-TMF7-HP1HP2.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株果实内HP1、HP2的表达量均明显低于野生型植株果实.转基因植株果实叶绿素含量比野生型明显升高,而叶片中的叶绿素含量无明显差异.该研究结果为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路.图6表2参15     

高浓度氯化镍胁迫下酿酒酵母组蛋白H4K5去乙酰化调控金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白(MTs)具有重金属解毒功能.组蛋白乙酰化/去乙酰化是表观遗传因子之一,并且参与基因的表达调控.然而,组蛋白乙酰化/去乙酰化在真核生物响应氯化镍胁迫过程中对金属硫蛋白基因的调控作用还不清楚.以酿酒酵母突变株H4K5R(该菌株模拟组蛋白H4赖氨酸5去乙酰化的状态)为试验材料,采用流式细胞术检测不同浓度氯化镍处理下酵母细胞的死亡率,发现突变菌株的生长状态和细胞存活率明显优于野生型菌株BY4741;qRT-PCR检测5 mmol/L氯化镍处理后,酿酒酵母金属硫蛋白基因Cup1、Crs5、Sod1及转录因子Cup2的表达量.结果显示,高浓度氯化镍胁迫下,野生型菌株中基因的表达水平均显著降低;耐镍菌株H4K5R中,金属硫蛋白基因Cup1表达量上调7.4倍,Crs5表达量显著下调2.56倍,Sod1表达量不显著上调,转录因子Cup2表达量上调3.81倍,并且表达水平均显著高于镍处理后的BY4741.本研究表明突变菌株H4K5R具有较强的镍耐受性;镍胁迫下,突变菌株中金属硫蛋白Cup1与转录因子Cup2的表达变化趋势与BY4741相反,说明组蛋白H4K5的去乙酰化可能通过改变基因表达模式,从而在酿酒酵母响应镍胁迫时发挥重要的调控作用.(图6表1参38)     

优良籼型恢复系转基因植株的获得及其遗传稳定性

报道了用基因枪转化法将雪花莲凝集素基因(gna)转移到优良籼型杂交稻恢复系蜀恢527中．PCR、PCR Southern blotting和Southern blotting等分子检测证明，外源基因以多拷贝单位点方式整合到受体基因组中并稳定遗传到转基因第三代(T2)．转基因第一代植株(TO)在株高和结实率上与相应的组培、种子实生苗植株相比，发生明显的不可遗传的变异，随着繁殖代数的增加，转基因植株恢复到与对照植株一致．Western blotting表明，目的基因在转基因植株中正确表达．蛋白活性分析显示，外源基因在转基因植株中合成的蛋白具有凝血生物活性，含量占可溶性总蛋白的0．1％左右．本文还对转基因技术在杂交稻育种中的应用进行了讨沦．图4表2参18     

编码水稻胞外核苷酸双磷酸酶基因的表达特性

NTPDase(Nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase,核苷酸双磷酸酶)在哺乳动物巾分布于细胞膜,可以水解细胞外ATP和其他核苷酸,从而调控胞外核苷酸代谢及信号应答.根据水稻NTPD基因序列设计引物,在不同胁迫条件样品中,通过PCR扩增水稻NTPD基因,结果表明水稻NTPD基因表达水平在盐胁迫样品中升高.为进一步分析水稻NTPD基因的功能,构建了该基因的过量表达、RNA干涉载体,通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴并获得阳性植株.半定量RT-PCR分析达到过量表达和干涉日的.在盐胁迫条件下,TO代过表达转基因植株表现出一定程度的抗胁迫能力,RNA干涉转基因植株的生长则受到抑制.图7表3参20     

番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传转化

以生菜(LactucasativaL.)为受体材料,将含有高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体pLBI用农杆菌介导法进行遗传转化,获得47株转基因生菜植株.PCR和Southern-blotting检测证实目的片段在T0代的整合,RT-PCR检测表明目的基因的转录.T0代植株赖氨酸(Lys)含量的测定分析表明,赖氨酸有不同程度的提高,比对照提高最高的可达9.46%.T1代植株PCR检测证明,目的基因能够遗传.图5表1参25     

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

农杆菌介导的抗除草剂基因转入两系杂交稻恢复系的研究

利用农杆菌水稻高效转化系统，成功地将外源ＢＡＲ基因转入实用性两系要交稻恢复系Ｒ１８７和秀水０４，经过除草剂Ｂａｓｔａ田间涂布试验，其阳性率达到９０％以上。对转基因植株同步进行的ＰＣＲ特异扩增和总ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测结果也证实抗Ｂａｓｔａ的植株中含有ＢＡＲ基因。讨论了应用转ＢＡＲ基因的方法提高两系杂交水稻制种纯度的条件。图２表１参３     

农杆菌介导将高赖氨酸蛋白基因导入谷秆两用水稻

采用农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因导入到谷秆两用水稻中，GUS组织化学染色、PCR扩增、Southem blot分析表明，该基因已经整合到水稻基因组中，测定9株转基因水稻叶片赖氨酸含量，大部分植株有明显的提高，最高幅度达到了22．71％，图6参15     

Heterologous overexpression of Populus euphratica BAK1;1 gene enhanced resistance to Pst DC3000 in tobacco北大核心CSCD

BRI1-ASSOCIATED RECEPTORKINASE1(BAK1), a leucine-rich repeat (LRR) receptor protein kinase, plays a significant role in brassinosteroid (BR) signaling. Furthermore, it combines with other LRR-RLKs protein to initiate immune response in plants. The objective of this study was to (1) investigate the function of the Populus euphratica BAK1;1 gene in the resistance of transgenic tobacco to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) and (2) discuss the regulation pathway of PeBAK1;1 involved in the resistance to plant pathogen. We cloned the cDNA sequence of the P. euphratica PeBAK1;1 gene, constructed the pBI121-35S::PeBAK1;1 over-expression vector, and then transformed it into wild-type tobacco by Agrobacterium-mediated transformation to obtain PeBA K 1;1-overexpressing transgenic tobacco plants. The bioinformatic analysis showed that the PeBAK1;1 protein contained all the structural features of the plant SERK family. The phylogenetic tree showed that PeBAK1;1 has the highest sequence homology with PtBAK1. The gene expression profile results indicated that the expression of PeBAK1;1 in the root was higher than that in the leaf and stem. The wild-type tobacco plants showed an obvious susceptibility to Pst DC3000, whereas the transgenic plants exhibited enhanced resistance to Pst DC3000. Compared with that of the wild-type (WT), the real-time PCR and quantitative real-time PCR analysis revealed that the expression of pathogenesis-related genes (including PR1, PR3, PR4, and PR5), BAK1-interacting receptor kinase 1 gene, and BONZAI1 gene was upregulated in 35S::PeBAK1;1 transgenic tobacco plants. In conclusion, the PeBAK1;1 gene plays a positive regulatory role in 35S::PeBAK1;1 transgenic tobacco against Pst DC3000, which can enhance the resistance of plants to pathogen. © 2018 Science Press. All rights reserved.