苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15     

二氧化硫胁迫下拟南芥miRNA表达谱分析

以拟南芥为材料,利用高通量测序技术并结合生物信息学分析方法,检测二氧化硫(SO_2)处理后拟南芥植株的小分子RNA表达谱,筛选SO_2胁迫响应microRNAs(miRNAs)分子,研究植物miRNAs对逆境胁迫的应答机制.结果发现,30 mg·m~(-3) SO_2处理72 h后,拟南芥地上组织小分子RNA长度分布发生改变,在对照组和SO_2组中均有大量特有的小分子RNA序列,说明SO_2胁迫可诱导拟南芥小分子RNA的表达改变.SO_2胁迫诱导186个保守miRNA和16个新miRNA分子差异表达,其靶基因主要涉及转录调控、信号转导、代谢、刺激响应等生理过程.差异表达的miR160和miR393可通过生长素信号途径调控植株生长发育,参与植物对SO_2的胁迫响应.本研究揭示了植物中参与SO_2胁迫应答的miRNA种类及作用机制,进一步阐明了miRNAs在植物抗逆应答过程中的作用.     

浮萍转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为开发浮萍分子标记技术,采用高通量测序技术获得浮萍转录组原始实验数据,经过生物信息学软件Trinity拼接后,获得74 797条unigene.进一步采用生物信息学分析软件MISA对所有的unigene进行SSR位点数据挖掘.共计搜索出14 250个SSR位点,分布在12 707条unigene中,出现频率为19.05%,SSR平均长度为19 bp,平均分布频率是1/6.57 kb.在浮萍转录组的SSRs中,二核苷酸与三核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占总SSRs的70.74%和25.37%.浮萍转录组数据中SSR序列共包括185种重复基元类型,二核苷酸重复基元AG/CT和三核苷酸重复基元CCG/CGG是优势重复基元,分别占总SSRs的69.19%和8.84%.综上表明浮萍SSRs位点具有极大的可开发性.     

人类无精症相关新基因ZNF313启动子的初步分析

采用PCR方法扩增了ZNF313基因的启动子序列,构建了含人ZNF313基因启动子不同片断的荧光素酶报告基因表达体系.以pRLTK为内参照质粒,瞬时转染HEK293T细胞,48h后收集细胞,测定荧光素酶的相对表达活性.结果发现,在ZNF313基因的启动子区域构建了4种荧光素酶报告基因表达体系,即pGL3215(-215bp～ 38bp)、pGL3160(-160bp～ 38bp)、pGL3133(-133bp～ 128bp)和pGL38(-8bp～ 128bp).其中pGL3215表达载体的荧光素酶相对表达活性最高;pGL3160和pGL3133表达载体的荧光素酶相对表达活性几乎相同,且是pGL3215的75%;而pGL38的荧光素酶相对表达活性急剧下降,接近于零.这表明,-133bp～-8bp区域内含有人ZNF313基因转录所必需的启动子序列.生物信息学的分析表明,两个SP1、一个AP2和一个TAg是人ZNF313基因启动子所必需的.图4参19     

龙眼胚性愈伤组织Cu/Zn-SOD分子伴侣基因CCS的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在龙眼体胚发生过程中的表达调控机制,以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR法,克隆了长960 bp含有完整开放阅读框的龙眼DlCCS核酸序列,其编码一个含有319个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号:FJ973472).生物信息学分析显示:该蛋白为亲水的、稳定的、含有跨膜结构域的酸性蛋白质,定位于叶绿体;与毛果杨、葡萄、拟南芥、水稻和锦鸡儿具有较高同源性,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域;预测其通过不同的磷酸化方式,改变酶活性及蛋白构象,参与龙眼体胚中超氧化物代谢以及金属离子转运等生物学过程,在氧化还原过程中发挥作用.利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,结果显示,从松散型胚性愈伤组织(Stage 1)到胚性紧实球形结构阶段(Stage 4),DlCCSmRNA的转录水平较低且波动小;当胚性紧实球形结构进一步发育到子叶形胚阶段(Stage 8),其表达量迅速增加,在成熟胚阶段(Stage 9)达到最高峰,提示DlCCS可能在龙眼体胚的中晚期起主要作用     

甘蔗泛素结合酶基因的克隆与表达北大核心CSCD

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因（Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme,ScUBc E2）并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用,选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库（Suppression subtractive hybridization,SSH）中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针,结合电子克隆技术和RT-PCR技术,以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,Me JA）、脱落酸（Abscisic acid,ABA）和水杨酸（Salicylic acid,SA）胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因（ScUBc E2;Gen Bank accession number：KJ577594.1）,该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框,编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示,ScUBc E2编码的蛋白分子量（Mr）为16.507×10^3;无信号肽,为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点,74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,ScUBc E2基因组成型表达,但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制,在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制,后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达,对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明,甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式,可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程,有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时,该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式,可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.     

基于多花黄精转录组的HIPPs/HPPs基因家族鉴定与表达调控

PcHIPPs/PcHPPs是一类细胞内可溶性金属结合蛋白,在调节植物重金属稳态、解毒机制、重金属耐受等方面发挥重要作用,目前关于HIPPs/HPPs基因家族在多花黄精中还未有人研究.基于多花黄精不同转录组数据,采用生物信息学进行理化性质分析、亚细胞定位和保守基序及系统进化树分析,并对其功能进行初步分析,研究HIPPs/HPPs基因在不同铅处理下的表达情况.结果表明：从多花黄精中鉴定出68个PcHIPPs和43个PcHPPs基因;PcHIPPs基因家族的氨基酸数为134-501,分子量介于15.53-53.09 ku之间,等电点介于5.12-9.88;PcHPPs基因的氨基酸数为101-352,分子量介于11.46-38.23 ku,等电点介于5.58-10.41;亚细胞定位预测表明,PcHIPPs/PcHPPs基因有73个分布在细胞核内;通过KEGG分析发现PcHPP3、PcHIPP28-5、PcHIPP28-6、PcHPP1-5参与到代谢过程;PcHIPPs/PcHPPs基因在多花黄精根状茎中主要发挥作用,在盐胁迫处理48 h下大部分PcHIPPs/PcHPPs基因表现出明显的下调...     

甘蔗光合系统Ⅰ亚基O基因的克隆与表达分析

光合系统Ⅰ亚基O(PhotosystemⅠsubunit O,Psa O)是光合系统Ⅰ中的蛋白亚基,在两个光合系统之间平衡激发能方面起着重要的作用.为研究Psa O基因的结构和功能,对甘蔗(Saccharum offi cinarum L.)叶片全长c DNA文库进行测序,获得光合系统Ⅰ亚基O基因的全长c DNA序列,命名为Sc Psa O(Gen Bank Accession Number:KF714498).生物信息学分析表明,该基因全长708 bp,开放阅读框435 bp,编码144个氨基酸;该基因所编码的蛋白定位于叶绿体基质,无信号肽,为疏水性非分泌碱性蛋白,二级结构多为无规则卷曲,含有PJN00046家族的保守结构域,参与能量新陈代谢及脂肪酸新陈代谢.同时,该基因在不同物种间具有较强的保守性,其中与同属C4植物的同源性较C3植物高.荧光定量PCR分析结果表明,甘蔗Sc Psa O基因在叶片中的相对表达量最高,具有一定的组织特异性;在氯化钠(Na Cl)、聚乙二醇(PEG)、氯化铜(Cu Cl2)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(Me JA)等外源胁迫下,其表达量均呈下调趋势,且以PEG胁迫下的下调表现最为明显.这些结果表明这几种外源胁迫可能抑制甘蔗Sc Psa O基因的转录水平表达,为其进一步功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用积累了基础资料.     

长期施肥酸性旱地土壤硝化活性及自养硝化微生物特征

构建微域培养结合梯度凝胶电泳(DGGE)、Illumina MiSeq高通量测序、生物信息学分析等分子生态学技术,以不施肥土壤为对照(CK),研究长期施化肥(NPK)和有机肥(OM)对酸性旱地土壤硝化活性及自养硝化微生物群落的影响,并认知其与土壤理化因子间的关系.结果表明,施化肥和有机肥显著提高土壤有机碳和无机氮含量,施有机肥提高土壤pH和总氮含量、降低C/N;供试土壤自养硝化作用占据主导(73.60%~85.32%),施肥显著提升土壤自养硝化活性,且施有机肥提升效果更为明显;微域培养后,OM土壤氨氧化古菌(AOA)和细菌(AOB)amoA基因绝对丰度及16S rRNA基因相对丰度显著上升,而CK和NPK土壤仅AOA相对丰度显著上升,即3种土壤AOA均有明显活性(主要类群为Nitrososphaera,99.30%),而AOB仅在OM土壤有活性(主要类群为Nitrosospira,99.99%),另外还发现OM土壤中亚硝酸盐氧化细菌(NOB)有较强活性(主要类群为Nitrospira,96.69%);逐步回归分析显示自养硝化活性显著受总氮含量影响,AOA和AOB amoA基因丰度分别受有机碳含量和pH影响,Nitrososphaera相对丰度与NO_3~--N含量显著正相关,而Nitrosospira和Nitrospira相对丰度则与C/N显著负相关.可见,长期施肥后土壤总氮含量的提升显著刺激自养硝化活性;以Nitrososphaera为主的AOA在酸性旱地土壤硝化作用中发挥了重要作用,施有机肥土壤pH上升及C/N下降刺激了Nitrosospira(AOB)生长,从而改变了酸性旱地土壤中活跃的自养硝化微生物类群.     

蛋白质组学及其在PAHs生物降解途径中的应用

蛋白质组学是研究生物体表达的全部蛋白功能的学科。随着双向电泳、生物质谱和生物信息学三大蛋白质组学技术的发展与成熟,蛋白质组学成为研究PAHs降解菌的生物降解途径中不可或缺的重要部分。阐述了这三大技术以及其应用于PAHs降解菌在特定多环芳烃污染物诱导前后的差异蛋白的表达,并展望了蛋白质组学三大技术应用于微生物降解多环芳烃机制方面的前景与挑战,以期对今后相关PAHs降解菌的培育驯化或生物降解途径的研究有一定指导作用。