沙打旺耐盐细胞系的筛选及特性分析

以沙打旺（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ａｄｓｕｒｇｅｎｓ） 无菌苗下胚轴切段为外植体,诱导愈伤组织．该愈伤组织通过逐步提高ＮａＣｌ 浓度以及在ρ（ＮａＣｌ） ＝１２ ｇ／Ｌ和无盐条件下往返培养的多步选择法,获得能适应ρ（ＮａＣｌ） ＝ １２ ｇ／Ｌ的耐盐细胞系（ＳＮｒ） ．在胁迫下ＳＮｒ 能显著积累脯氨酸;同时还具有对ＰＥＧ的交叉抗性,和ＣＫ 相比愈伤组织可溶性蛋白ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ图谱,出现四条新多肽（ Ｍｒ≈３１×１０３、３０×１０３ 、２８×１０３ 、２６×１０３） ,它们可能与耐盐性有关．     

野生与养殖长吻血液及不同器官同工酶的比较

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ－Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｓｉｓ），对野生及养殖长吻Ｕａｉ心脏、肾脏、肌肉、肝脏四个器官及血液的ＬＤＨ（ＥＣ．１．１．１．２７）、ＰＯＤ（ＥＣ．１．１．１．１）、ＥＳＴ（ＥＣ．３．１．１．１）、ＭＤＨ（ＥＣ．１．１．１．３７）同工酶所获电泳图谱进行对比分析，发现以上各酶在不同组织器官中均表现出组织特异性；野生Ｕａｉ和养殖Ｕａｉ四种同工酶也存在差异；ＬＤＨ同工酶电泳带分     

芹菜赖氨酸加苏氨酸抗性细胞系的选择

用４ｍｍｏｌ－／Ｌ浓度的赖氨酸加苏氨酸作为选择压，经相同浓度液体和固体选择培养基连续选择，从未经诱变处理的芹菜胚性愈伤组织筛选出一个稳定的赖氨酸加苏氨酸抗性细胞系并得到再生植株。抗性细胞系再生植株整株的氨基酸含量比对照组植株高１０倍左右。但是地上部分氨基酸含量，抗性细胞系再生植株比对照植株有所降低。两种植株叶片的细胞色素氧化酶同工酶谱有明显差异，抗性细胞系再生植株有４条谱带，而对照植株只有两条谱带     

H2O2对抗旱性不同玉米品种愈伤组织抗氧化系统的影响

两个玉米品种愈伤组织经１０－４ｍｏｌＬ－１、１０－３ｍｏｌＬ－１和１０－２ｍｏｌＬ－１Ｈ２Ｏ２处理３ｈ后,电解质泄漏率加大;Ｈ２Ｏ２和ＭＤＡ含量增加;ＡｓＡ和ＣＡＲ含量的减少．１０－４ｍｏｌＬ－１的Ｈ２Ｏ２处理对愈伤组织产生的氧化伤害较小．抗旱性较强品种ＰＡＮ６０４３愈伤组织的抗氧化酶（ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＡＰ和ＧＲ）活性高于抗旱性较弱品种ＳＣ７０１,ＡｓＡ和ＣＡＲ含量的下降程度低于ＳＣ７０１．ＰＡＮ６０４３愈伤组织具有较强的抗Ｈ２Ｏ２能力,与含高活力抗氧化系统密切相关     

转化血型用蕃茄α—D—半乳糖苷酶的分离,纯化及理化性质

成熟蕃茄匀浆后，经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＳｅｐａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ－Ａｇａｒｏｓｅ亲和层析，获得了α－Ｄ－半乳糖苷酶（Ｃ．Ｅ．３．２．１．１１）。酶制剂经ＰＡＧＥ检测为一条带；ＳＤＳ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得酶Ｍ，为３４０００；比活力５２．９Ｕ／ｍｇ．；提纯倍数为５２９０；产率为４５％。酶专一催化以α－Ｄ－半乳糖为末端ａ－（１，３）连接的糖苷     

雷公藤新的降倍半萜成分

从贵州产雷公藤（ＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍｗｉｌｆｏｒｄｉＨｏｋＦ．）中分离得到８个化合物,其中一个为新的降倍半萜化合物雷公藤酮（１）,根据光谱（ＩＲ,１ＨＮＭＲ,１３ＣＮＭＲ,ＨＲＭＳ,ＣＤ等）数据分析并通过Ｘ射线晶体分析确定了结构;另外７个化合物分别鉴定为雷公藤素（２）,（±）６氧２（４′羟基３′,５′二甲氧苯基）３,７二氧杂二环［３．３．０］辛烷（３）,ｔｒｉｐｔｅｒｉｆｏｒｄｉｎ（４）,雷公藤内酯酮（５）,雷公藤内酯醇（６）,雷公藤内酯甲（７）和对乙氧基乙酰替苯胺（８）．其中,３和８均为首次从该植物中分离得到．用二维核磁共振谱对３的氢谱和碳谱进行了指定     

菲律宾新的工业废物交换计划

菲律宾新的工业废物交换计划Ｇ．Ｆａｖｉｌａ，，３／ＦＬｏｗｅｒＬｅｖｅｌ，ＤＡＰＢｕｉｌｄｉｎｇ，ＳａｎＭｉｇｕｅｌＡｖｅｎｕｅ，Ｐａｓｉｇ，ＭｅｔｒｏＭａｎｉｌａ１６０１，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ菲律宾环境商会菲律宾环境商会（ＰＢＥ）最近在推行新的工...     

转化血型用蕃茄α－D－半乳糖苷酶的分离、纯化及理化性质

成熟蕃茄匀浆后，经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＳｅｐａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ－Ａｇａｒｏｓｅ亲和层析，获得了α－Ｄ－半乳糖苷酶（Ｃ．Ｅ．３．２．１．１１）。酶制剂经ＰＡＧＥ检测为一条带；ＳＤＳ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得酶Ｍｒ为３４０００；比活力５２．９Ｕ／ｍｇ·；提纯倍数为５２９０１产率为４５％．酶专－催化以α－Ｄ－半乳糖为末端ａ－（１，３）连接的糖苷键，以ＰＮＰＧ（对硝基苯－α－Ｄ－半乳糖昔）为废物，酶催化反应的Ｋｍ＝０．１１ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ为６７μｍｏｌ·ｍｇ１－·ｍｉｎ－１．ｔ稳定范是０～３５℃；ＰＨ稳定范围是４．０～７．０．最适ｐＨ为５．１．半乳糖是酶的竞争性抑制剂；Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｇ＋和ＥＤＴＡ对酶活性无影响．纯酶制剂可作为Ｂ型血向Ｏ型血转化的工具酶液．     

EoNPV的限制性酶切图谱及polyhedrin基因和egt基因的定位

用８种限制性内切酶酶解茶尺蠖Ｅｃｔｒｏｐｉｓｏｂｌｉｑｕａ核型多角体病毒（ＥｏＮＰＶ）基因组ＤＮＡ，获得大于０．８８ｋｂ的片段数分别为７、３８、１９、１７、１６、９、３２和１４．由此统计，基因组平均大小大于１１８．５ｋｂ，即Ｍｒ约大于７８．６×１０６．用ＢｍＮＰＶ的多角体蛋白（ｐｈ）基因和ＡｃＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因为探针，应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法，将ＥｏＮＰＶ的ｐｈ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩＤ、ＥｃｏＲＩＭ、ＥｃｏＲＶＬ、ＨｉｎｄⅢＦ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＨ和ＸｈｏＩＢ片段上，将ｅｇｔ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩｌ、ＥｃｏＲＩＫ、ＥｃｏＲＶＡ、ＨｉｎｄⅢＨ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＢ、ＸｈｏＩＩ片段上．通过克隆和酶切鉴定ＥｃｏＲＩＭ和ＥｃｏＲＶＬ片段，测定ｐｈ基因部分序列，并以ＥｃｏＲＩＭ为探针对基因组酶切印迹进行杂交，制作了ＥｏＮＰＶｐｈ基因和ｅｇｔ基因区的酶切图谱，推定ｅｇｔ基因保守区位于ｐｈ基因上游约４．５５ｋｂ处．     

化学诱变结合结构类似物法选育高苯丙氨酸解氨酶菌种

ＥＭＳ诱变结合结构类似物法提高含ＰＡＬ出发菌株红酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐ．ＣＩＢＡＳＡ１４０１１００ 生物转化能力阳性率为３５．５ ％ ,部分突变株ＰＡＬ转化能力提高１ 倍以上,其中Ｅ１０５,Ｅ２４０ 具有快速转化能力,反应３ ｈＬＰｈｅ累积浓度达到１ ｇＬ左右．φ１０％ 甘油和３０ ｇＬＧｌｕ 对ＰＡＬ转化具有明显的稳定作用．用含φ１０％ 甘油和３０ ｇＬＧｌｕ 的反应液进行生物转化制备,Ｅ１０５ 和Ｅ２４０ 在２４ ｈ 期间ＬＰｈｅ 质量浓度大于２０ ｇＬ,转化率达８０ ％ ．     

Xα21基因导入水稻及转基因植株的鉴定

以水稻愈伤组织为受体、质粒pCXK1301为Xα21基因供体，用农杆菌EHA105和PDS－1000／He基因枪转化受体，经Hyg浓度梯度筛选，获得一些转基因水稻植株，GUS检测、PCR扩增和Southern杂交分析表明，报告基因（GUS）、选择标记基因（Hyg^r）和抗白叶枯病基因Xα21都已整合入转化水稻基因组中，Southern杂分析显示了Xα21基因在转化水稻基因组中整合的拷贝数。田间接菌鉴定表现抗白叶枯病。     

水浮莲(Pisia stratiotes Linn.)的体外再生与繁殖

建立了水生单子叶植物水浮连(Pistia stratiotes Linn.)通过器官发生途径的体久高效再生与繁殖方法.采用叶、茎节和匍匐茎为外植体诱导愈伤组织,只有茎节能够在添加2,4-D和6-BA的MS基本培养基上形成合愈伤组织,而叶和茎在含有不同组合植物激素的培养基上都不能够诱导愈伤产生.将愈伤组织转到添加6-BA和NAA的MS固体分化培养基可以在2wk内形成小苗,将小苗移至含NAA的MS固体生根培养基形成完整的植株.将生根苗转入无植物激素的不同基本液体培养基里比较其生长效果,其中含有2倍大量元素的SH培养基最适合其生长繁殖,在2wk内可由1个小苗每秒殖出10个新的植株.本研究是关于该植物体外再生的首次报道.水浮莲体外再生及繁殖系统的建立不公可以用于在无菌条件下进行基础生理生化研究,还可以用于该植物遗传达室转化系统的建立.由于该植物生长迅速且为无性繁殖,生产成本低,通过基因工程方法表达外源基因将可以用于重组药用蛋白的生产及污染水体的转基因植物修复.     

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

长期继代培养马铃薯愈伤组织的植株再生

对影响马铃薯愈伤组织发生、生长和长期继代培养的愈伤组织再生植株的几种因素进行了研究。马铃薯茎段的愈伤组织发生频率高于叶片的愈伤组织发生频率。Ｄｉｃａｍｂａ诱导茎段和叶片的愈伤组织发生频率在９０％以上；而２，４－Ｄ的诱导效果不佳并诱发外植体生根。再生培养其中加入０．５ｇ／Ｌ的酶解酷蛋白是必需的；蔗糖的浓度以２％－４％为宜；附加ＺＴ２．０ｍｇ／Ｌ、ＧＡ０．１ｍｇ／Ｌ可使长期继代的愈伤组织的植株再生频率     

麻疯树胚乳愈伤组织诱导及其污染消除

经过比较分析各种消毒方法,获得了较为理想的麻疯树(Jatrophacurcas)胚乳愈伤组织,并动态观察其类型、形态特征、增殖速率和形态发生能力,为麻疯树胚乳植株再生及愈伤组织和细胞培养生产药用成分奠定了基础.以麻疯树成熟胚乳为外植体进行愈伤组织的诱导,测试0.4mg/L的分裂素(BA、KT与TDZ)与2.0mg/L的生长素(IAA、IBA、NAA与2,4D)搭配组合的诱导效果.结果表明,对胚乳愈伤诱导效果而言,2.0mg/L的2,4D效果最好,NAA的效果次之,IBA又次之,IAA的效果最差.BA和KT诱导效果差异不显著,TDZ的添加可促进胚乳愈伤组织的诱导.选择适宜的消毒剂(种类、浓度)和消毒(处理)时间对胚乳外植体的接种成功具有至关重要的作用.在本试验所采取的灭菌方式中,用70%酒精处理30s,然后用10%NaClO处理25min,灭菌效果最佳,同时对胚乳外植体的生长影响最小.图3表1参23     

大型蚤对五价砷抗性选择的响应

金属污染对栖息在该环境中的生物具有强大的选择力,生物若能进化出对该金属的抗性则能在该环境中生存下去,否则将会灭绝。人工模拟的选择方法可以用来研究生物对金属的抗性进化。为了探索大型蚤(Daphnia magna)是否能进化出对五价砷(As(Ⅴ))的抗性,采用多代选择的方法对其进行了As(Ⅴ)诱导的抗性响应研究。依据本实验室大型蚤对As(Ⅴ)的96h半致死浓度(4.25 mg·L~(-1)),试验选取As(Ⅴ)亚致死浓度(8.0 mg·L~(-1))对大型蚤进行选择,每代选择30%~50%对As(Ⅴ)耐受性高的大型蚤转移至不加As(Ⅴ)环境下继续繁殖得到下一代,并重复该选择过程至获得第五代(F5)终止试验。以选择组F5代及对照组F5代大型蚤为测试目标,考察其在As(Ⅴ)继续暴露下的存活时间以期获得具As(Ⅴ)抗性大型蚤。结果显示,在F5代中,选择组大型蚤在As(Ⅴ)(8.0 mg·L~(-1))暴露下的存活时间相比对照组显著延长175%,证实了大型蚤对As(Ⅴ)的进化抗性。进一步研究发现,选择组F5代与对照组F5代相比繁殖力下降19.96%,平均每批产仔量降低15.71%。这表明经过五代人工选择后,大型蚤能够进化出对As(Ⅴ)的抗性,而这种抗性的进化伴随以生物适应性参数的降低为代价。另外,大型蚤对这种抗性的获得机制(对As(Ⅴ)的累积和脱毒机制)仍需进一步研究。     

Pseudomonas sp.L19抗除草剂AHAS基因的克隆、表达及特性

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.从长期使用甲磺隆的农田土壤中分离到1株对乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂有广谱抗性的菌株L19,根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列系统发育分析,将其鉴定为假单孢菌属(Pseudomonas sp.).利用PCR技术从Pseudomonas sp.L19的总DNA中克隆AHAS基因,氨基酸序列比对结果表明,L19与对除草剂敏感菌株P.putida KT2440的AHAS调节亚基氨基酸序列完全相同,而催化亚基有4个氨基酸位点不同:[Val 29→Ala(L19→KT2440),Pro93→Ser,Val 345→Ala,Pro 484→Arg].分别将菌株L19与KT2440的AHAS催化亚基克隆到pET29a(+)的多克隆位点,构建了表达载体pET-L19AHASc和pET-KT2440AHASc,通过镍柱亲和层析纯化得到带有组氨酸标签的乙酰羟酸合酶.抗性试验结果表明菌株L19的乙酰羟酸合酶对四大类乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的抗性均要强于KT2440的乙酰羟酸合酶,对甲磺隆、咪唑乙烟酸、唑嘧磺草胺和嘧草醚的抗性倍数分别达到53.6、9.3、8.2和9.5倍.菌株L19的乙酰羟酸合酶比活力、对ThDP和Mg2+的Kc值相应地比KT2440乙酰羟酸合酶的要低;而对底物丙酮酸钠的米氏常数Km值要比KT2440乙酰羟酸合酶的要高近1倍.     

水稻高效转化系统的建立

利用基因枪轰击和农杆菌介导两条途径转化水稻成熟胚、幼胚、幼穗诱导来源的愈伤组织．实验发现，外植体来源影响愈伤组织的诱导和转化．对于同一水稻品种，幼胚、幼穗在NB2培养基上比成熟胚易于诱导出胚性愈伤组织；转化中，无论是经农杆菌介导还是基因枪轰击，幼胚和幼穗来源的愈伤组织能以较高的转化频率获得转化体并再生成苗．同时，愈伤组织的诱导和转化效果也受基因型的影响．另外，转化途径对转化效率的影响较大，基因枪轰击比农杆菌介导转化频率高、再生频率强．并且，在轰击前6h至轰击后18h，将愈伤组织保持在附加20g／L甘露醇的培养基中，有利于转化率的提高．图2表3参17