甲基营养型芽孢杆菌H0对羽毛产寡肽的降解特征

寡肽具有较高的营养价值和多种生理功能,筛选高产寡肽的羽毛降解菌株,并将其用于羽毛寡肽的生产,对高效利用废弃羽毛资源、提高产品附加值具有重要意义.以寡肽产率为评价指标,从16株羽毛降解菌中分离到一株高产寡肽的羽毛降解菌H0,通过形态观察、生理鉴定和系统发育分析,初步鉴定菌株H0为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus).对其降解羽毛产寡肽特性和羽毛寡肽特征进行初步探究,发现该菌在最佳初始pH(11)和最佳温度(40℃)下发酵72 h,羽毛几乎完全降解,寡肽产率达38.19%(占可溶性总肽的67.53%),同时检测到11.11%的游离氨基酸.液质联用(LC-MS/MS)分析结果表明所产寡肽的分子量(Mr)主要分布在1 300以下,且主要是由5-10个氨基酸组成的短肽,富含支链氨基酸,推测其是羽毛降解液呈现抗氧化活性的主要原因.本研究表明甲基营养型芽孢杆菌H0具有较强的降解羽毛产寡肽能力,可为羽毛寡肽产品的开发提供优质微生物资源和科学依据.     

短小芽孢杆菌胞外蛋白质组双向电泳分析及碱性胁迫下胞外差异蛋白鉴定

短小芽孢杆菌Bacillus pumillus SCU11是本实验室从富含蛋白质的生活垃圾中分离并诱变得到的具有高碱性蛋白酶活性的菌株,其分泌的碱性蛋白酶具有很好的生皮脱毛效果,在生物制革工业具有良好的应用前景.短小芽孢杆菌胞外蛋白质多达数百种,为了解其组成情况,采用LB培养基培养短小芽孢杆菌SCU11,以三氯乙酸/丙酮法沉淀发酵上清液中的蛋白质,通过双向电泳分析,建立了具有较高分辨率的短小芽孢杆菌胞外蛋白的双向电泳图谱.在此基础上,分析了碱胁迫条件下短小芽孢杆菌胞外蛋白质的双向电泳图谱,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定了10个差异蛋白点,其中有5种为胞外分泌蛋白,包含2种胞外蛋白酶.本研究结果表明与呼吸作用及运动相关的蛋白可能参与了短小芽孢杆菌碱胁迫的应答反应.     

响应面法优化短小芽孢杆菌SCU11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析

短小芽孢杆菌SCU11是由本实验室分离的野生菌株BA06经过复合诱变得到的高产碱性蛋白酶菌株,其产生的碱性蛋白酶在生物制革领域具有很好的应用前景.为进一步提高菌株的蛋白酶产量以满足工业生产的需求,本研究利用响应面法优化菌株产蛋白酶的发酵培养条件.在前期单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、中心组合实验设计和响应面分析法,确定了当黄豆粉浓度为53.3 g/L,温度为28℃时,蛋白酶活有理论最大值8 884 U/m L,摇瓶实验验证酶活为8 768 U/m L,达到理论预测值的98.7%,比优化前酶活提高了1倍.为了解优化的发酵条件使蛋白酶产量提高的原因,对短小芽孢杆菌蛋白酶基因及相关调控基因的表达情况进行荧光定量PCR分析,结果显示,优化后5种蛋白酶基因的表达量上调,1种表达量下调;5种蛋白酶相关调控基因的表达量增加,2种基因表达量降低.推测是优化后正调控基因表达量的增加以及负调控基因表达量的降低,促进了短小芽孢杆菌胞外蛋白酶基因转录水平的提高,导致胞外蛋白酶产量增加.本研究采用响应面法优化发酵条件使短小芽孢杆菌SCU11蛋白酶产量提高了1倍,并为阐明其表达调控机制奠定了基础.(图3表7参24)     

两株吡啶降解菌的分离与鉴定

为了研究石油污染土壤中含氮杂环化合物的降解情况,该研究选择吡啶作为目标污染物,采用选择性富集培养的方法,从45份石油污染土壤样品中,分离得到260株降解吡啶污染物的高效降解菌株,选择降解效率最高的2株吡啶降解菌命名为菌株4-11和2-13,进行种属鉴定、细菌的生长情况和吡啶降解性能的考察.实验证明,60 h菌株4-11和2-13对质量浓度为1000 mg·L-1吡啶的降解率分别达到65.5%和64.1%.通过形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列比对分析,确定菌株4-11属于产硫酸杆菌(Thiobacillus)与Thiobacillus intermediu 同源性最高,为99.8 %,菌株2-13属屈挠杆菌(Flexibacter)与 Flexibacter giganteus同源性最高,为99.9 %.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的随机突变

碱性蛋白酶(DHAP)属于丝氨酸蛋白酶家族(S8A),是由275个氨基酸残基组成的单链多肽,没有二硫键,以Asp32、His64、Ser221作为活性中心.采用易错PCR方法,对短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(GenBank登录号:AY458140)进行随机突变.在大肠杆菌中建立随机突变文库,然后转化枯草芽孢杆菌WB600,构建枯草芽孢杆菌突变文库,筛选出酶活性提高或最适反应温度和pH值有所降低的突变体.通过3轮的随机突变和筛选,获得2个阳性突变体pP43AP-M166和pP43AP-M375.其中pP43AP-M166在不同的温度和pH条件下,与出发菌株相比,酶活都有不同程度提高,特别是当反应温度为50℃、pH为10时,突变蛋白酶酶活性提高1.23倍,表现出很好的热稳定性.测序结果表明,该突变体含有一个氨基酸置换,位于碱性蛋白酶催化三联体活性中心His64旁,与其只有一个氨基酸残基相隔.     

一株抗肿瘤放线菌的鉴定及生物活性

为开发青藏高原沙地生态系统放线菌资源,首次从位于青藏高原东北部的青海湖沙岛土壤样品中选择性分离培养出一株具明显抑菌及抗肿瘤活性放线菌Sd-31.通过生理生化特性、化学分类学以及16S rRNA序列分析鉴定,菌株为砖红链霉菌,命名为Streptomyces lateritius Sd-31;双层琼脂法检测菌株抑菌活性,表明菌株对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有显著抑制作用;通过Hoechst染色荧光显微镜观察及MTT法细胞毒性试验,确定菌株发酵液有明显的诱导肿瘤细胞凋亡活性且与处理浓度成正相关;纸片法研究菌株发酵液活性稳定性,结果表明,20~80℃处理后发酵液抑菌活性稳定,100℃条件处理后发酵液抑菌活性降低;在酸性及中性条件下发酵液活性稳定,碱性条件下随着pH值的增加发酵液抑菌活性降低.以上结果为抗肿瘤药物的研究提供了理论数据.     

甲基营养型芽孢杆菌的分离鉴定及在防蝇产蛆环境防治中的应用

从华南农业大学试验基地土壤筛选芽孢杆菌,得到17株芽孢杆菌,结合插入序列指纹图谱对分离获得的芽孢杆菌进行聚类分析,共分为3个类群;测定各类群代表菌株的16S rDNA序列,分析其系统发育,结果表明类群Ⅰ代表菌株RF2与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus CBMB 205~T)相似性为99.48%;类群Ⅱ代表菌株RF10与好氧芽孢杆菌(Bacillus aerophilus 28K~T)相似性为99.61%;类群Ⅲ代表菌株RF16与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC14579~T)相似性为99.87%.餐厨垃圾试验表明类群Ⅰ RF2具有餐厨垃圾防蝇产蛆效果;并且生理生化、碳源利用以及抗菌谱试验表明菌株RF2在碱性条件下可以将葡萄糖分解成丙酮酸并脱羧氧化生成二乙酰,既能够将氨转化为氨基酸和胞内其他含氮化合物,也利用多种碳源供自身生长,能够拮抗多种植物病原菌(水稻纹枯病、尖刀廉孢菌、香蕉枯萎病).而RF2在含有难溶性的磷酸盐[Ca_3(PO_4)_2]条件下可分泌出有机酸降低pH值,使难溶性磷酸盐溶解供自身利用.因此本研究获得的菌株RF2是一株具有较强促生作用和应用于防蝇产蛆的芽孢杆菌,具有很好的应用前景.     

一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选、纯化及酶学性质

从南宁酒厂附近土壤中筛选到一株产淀粉酶的野生菌株GXBA-4,经革兰氏染色、芽孢染色以及16SrDNA鉴定,初步确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien).将该菌株发酵液经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化出一种α-淀粉酶,该酶相对分子质量约为57×103;反应最适温度为40~45℃,适应温度范围广,30℃时仍具有80%以上的相对活力;最适pH为5.0,为低温酸性淀粉酶.该酶水解可溶性淀粉的产物,经HPLC检测主要是以葡萄糖,麦芽糖以及麦芽三糖为主的低聚糖,分别以α-环糊精、β-环糊精、可溶性淀粉、玉米生淀粉为底物,还原糖产物比为0:0:99:3.4,表明该酶为典型的α-淀粉酶.     

一株桃树内生真菌Pestalotiopsis vismiae N1培养条件优化与抗氧化、抗菌活性分析

对一株内生真菌韦司梅拟盘多毛孢(Pestalotiopsis vismiae)的培养条件进行探究,在此基础上进一步对其发酵提取物抗氧化、抗菌活性进行分析.通过测定菌丝的生长速度寻找菌丝培养适宜的温度、碳源、氮源和pH,并采用正交试验优化培养条件;通过测定菌株深层发酵液提取物对羟基和DPPH自由基的清除率以分析其抗氧化活性;通过测定菌株深层发酵液提取物对多种病原细菌抑菌圈大小的影响来分析其抗菌活性.结果表明,韦司梅拟盘多毛孢菌丝最适宜培养温度为25℃,在该温度培养条件下菌丝生长最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为酵母提取粉,最佳初始pH为6.5,这3种因素的显著性差异大小顺序为碳源氮源 pH;菌株深层发酵液提取物具有良好的抗氧化活性,其对羟基自由基和DPPH自由基清除率的EC50分别为1.19 mg/mL和0.56 mg/mL;菌株发酵液提取物对铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用;深层发酵液提取物抗氧化和抗菌活性具有一定的稳定性.本研究结果可为深入开发利用该真菌资源提供科学依据.(图12表3参26)     

抗真菌多肽捷安肽素发酵条件的研究

对筛选出的一株芽孢杆菌ZK发酵产物抗真菌多肽捷安肽素的发酵培养基组分(碳源、氮源及无机盐)和工艺条件(发酵温度、起始pH,摇床转速,装液量)进行了摸索,通过单因素实验和正交优化实验,确定了ZK菌株发酵培养基最佳组成:生物氮素3.5％、葡萄糖3％、酵母膏0.08％、MgSO4·7H2O 0.5％、KH2PO4·3H2O 0.1％;最适温度为32℃;最适初始pH为8.0.在250 mL三角瓶中装50 mL培养基,于150 r min-1的旋转摇床上32℃振荡培养72 h,ZK菌株产捷安肽素的量达到最大.图8表5参14     

不动杆菌生物乳化剂活性成分研究

通过乳化活性分析、化学成分分析和相关基因的分析,对3株海洋来源的不动杆菌分离株和2种不动杆菌模式菌的生物乳化剂产生能力和活性成分进行了分析,结果表明,这些菌都能产生生物乳化剂.通过PCR检测,其中只有深海菌株wrl0242l编码与乳化剂Emulsan产生密切相关的酯酶基因.气质联用仪证明该菌所产的乳化剂含有脂肪酸组分,主要是正十六烷酸和正十八烷酸,表明菌株wp02421产生的乳化剂与Emulsan类似,糖脂是主要活性成分之一.此外,通过PCR检测,证明了5株不动杆菌全部编码外膜蛋白A基因(ompA).它们的氨基酸序列与Acinetobacterradioresistens KA53的乳化剂Alasan中的主要活性蛋白AInA的I司源性为71.26%～80.23%.以上结果表明,5株菌的生物乳化剂中都可能含有AlnA的乳化蛋白,而菌株wp02421同时还产类似Emulsan的糖脂.     

葡萄糖对芽孢杆菌降解水体中4,4'-二溴联苯醚的促进作用

为了探究4,4'二溴联苯醚(BDE-15)在水环境中的生物降解过程及其影响因素,在实验室内利用筛选得到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)对BDE-15进行生物降解试验,并研究了外加碳源和高初始浓度BDE-15对微生物降解能力的影响.结果表明,在葡萄糖作为外加碳源条件下芽孢杆菌能降解水体中BDE-15,4d后菌株对BDE-15的降解率为28％,再次添加葡萄糖可提高降解率至55％.高质量浓度(50 mg·L-1)BDE-15能抑制芽孢杆菌生长,并显著影响菌株对BDE-15的降解能力.     

一株耐冷菌所产降解酶的特性及应用

从我国寒冷地区筛选到一株能产低温降解酶的菌株.细菌学形态及16S rDNA鉴定表明,该菌株属希瓦氏菌属(Shewanella),最适生长温度为5～15℃,属耐冷菌,并暂命名为Shewanella sp.J5.菌株J5分泌的降解酶中蛋白酶和淀粉酶所表现的活力较高,在0℃下分别仍能保持20%和40%的酶活性,最适温度分别为40℃和30℃,最适pH分别为8.0和7.0～10.0,且对热敏感,属于碱性低温酶;金属离子中Mn2+、Fe2+对蛋白酶有明显的促进作用,而淀粉酶对金属依赖性较小;HPSEC结果表明,低温蛋白酶在水解酪蛋白过程中,对相对分子质量10 000的大分子肽水解能力很强.脱氢酶酶活测定结果表明,低温下菌株活性显著高于常温活性污泥,5℃下,添加菌株J5到活性污泥中可使废水COD去除率提高33%.因此,该菌株在低温污水处理上具有一定的应用前景.     

解淀粉芽孢杆菌MY001菌株对几丁质的降解及对芦笋茎枯病菌的拮抗作用

几丁质每年自然总产量高达100亿吨,目前由于工业上缺乏清洁高效的几丁质降解工艺,几丁质资源的利用受到严重制约.以壳聚糖为唯一碳源从土壤中分离筛选出一株具有产壳聚糖酶能力的菌株MY001,发酵上清酶活力约为2.7 U/mg,利用16S rDNA、gyrA及gyrB基因测序的方法将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).通过分析MY001菌株在不同培养基中的生长曲线特点,结合MY001菌株降解后的几丁质的扫描电镜观察结果,发现该菌株可以直接利用几丁质.另外,发现该菌株对芦笋茎枯病菌[Phomopsis asparagi (Sacc.) Bubak]具有拮抗作用.当胶体几丁质和MY001菌株同时存在时,对芦笋茎枯病菌的抑制更加明显.上述结果表明,解淀粉芽孢杆菌MY001菌株具有降解几丁质和拮抗芦笋茎枯病菌的功能,而且添加几丁质具有拮抗增效作用,因此该菌株有望用于几丁质资源清洁利用和农作物真菌病害生物防治.     

产吲哚金黄杆菌YM5毒性相关基因及其急性经口毒性

产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)YM5是本实验室分离所得的一株具有高效羽毛角蛋白降解能力的革兰氏阴性菌,具有潜在的工业应用价值,但部分产吲哚金黄杆菌的相关株系被报道可能为医院条件致病菌.本研究通过测定YM5全基因组序列,分析其基因组中毒性相关功能基因,结合小鼠急性经口毒性试验,来评价YM5的生物安全性.结果显示,YM5基因组内不含毒性相关基因.YM5菌液及其羽毛发酵液对小鼠半数致死量(LD50)大于20 g/kg BW,属实际无毒级;处理14 d后,小鼠血清中谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)、尿素(BUN)、肌酐(Cre)、血糖(GLU)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)与对照组均无显著性差异(P0.05).本研究表明YM5菌液及其羽毛发酵液对哺乳动物安全无毒副作用,可应用于工业生产.     

沙里院褐球蚧蜜露对病原真菌蜡蚧轮枝菌侵染力的影响

蚧虫在取食和发育过程中排泄大量蜜露,通过研究蜜露对病原真菌侵染蚧虫的影响,可为应用病原真菌防治蚧虫提供科学依据.于2007年4月自山西省太原市苹果树上沙里院褐球蚧Rhodococcus sariuoni Borchsenius雌虫虫体表面采取蜜露,用化学分析方法和氨基酸自动分析仪测定其化学成份;将蜜露稀释为10%、20%、30%、40%、50%共5个浓度,对蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的两个菌株No.V3.4504和No.V3.4505进行培养,比较其对菌株胞外蛋白酶和几丁质酶活性的影响.结果发现,该蚧虫蜜露包含可溶性糖(占69%)、水分(占26%)和18种氨基酸.当蜜露稀释浓度为10%时,菌株No.V3.4504的蛋白酶活性最大,为(4.45±0.18)U/mL;随着蜜露浓度增加,蛋白酶活性呈下降趋势;在蜜露浓度为20%时,菌株No.V3.4505的蛋白酶活性出现最大值,为(8.5±0.71)U/mL;随后,蛋白酶活性持续降低.两菌株几丁质酶的活性与蛋白酶活性有相同的变化趋势.在培养基中分别加入氨基酸Ala、Met、Gly、Pro,发现加入Met使菌株No.V3.4504和No.V3.4505的蛋白酶活性分别增长了256.9%和215.7%.表明低浓度的蜜露和培养基中加入适当Met能提高蜡蚧轮枝菌对蚧虫的侵染力.图3表3参14     

皮革废物铬革屑的微生物学处理研究Ⅰ:降解铬革屑的微生物筛选及诱变

从不同来源的微生物中筛选出能粗效降解革屑的皱绒青霉 Ａ Ｓ３ ．１０６６ 菌株,可溶性蛋白得率达５３ ．５ ％ ;该株经紫外诱变获得高产蛋白酶诱变株 Ａ Ｓ３ ．１０６６ Ｅ,其蛋白酶活性较原始菌株高３ 倍     

3株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定

从云南温泉的污泥样品中分离到3株产蛋白酶的高温菌SB11、SB31和SC5,通过其形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析等,初步鉴定这3株菌都属于土芽孢杆菌属(Geobacillus),其最适生长温度为60℃,最适pH为6.三者的蛋白酶活力分别可达35.6、26.1和26.6UmL-1,最适酶反应温度都在70℃以上,其中菌株SB31的蛋白酶其最适酶反应温度高达80℃,远高于一般动植物来源的蛋白酶.图4表1参11     

地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

一株多菌灵降解菌NY97-1的分子鉴定及GFP标记

用PCR方法扩增的多菌灵降解菌NY97-1的16SrDNA片段经TA克隆后,进行序列测定和BLAST同源序列比较分析,确定了其分类地位为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus,B.p).经BamHⅠ酶切的启动子探针载体pUC19-gfp与NY97-1基因组DNA的Sau3AⅠ酶切片段酶连,酶连产物转化E.coliDH5a,建立B.p的启动子基因文库.挑选其中的两个强阳性克隆,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组的启动子活性片段F4、F5,构建大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pNW33N-F4-gfp、pNW33N-F5-gfp.通过电转化得到gfp在B.p中的两株标记菌株.在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证明活性片段F4、F5均具有组成型启动子的功能,实现了gfp基因在B.p中组成型表达,且遗传稳定,为今后研究多菌灵降解菌B.p在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下了基础.图3表2参20