一个硫化叶菌病毒启动子的分离与鉴定

几乎所有古菌病毒基因组中无RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)等组成基本转录装置的同源蛋白编码序列,而且启动子活性对病毒感染过程中病毒基因的转录上可能具有重要的影响.为进一步揭示古菌病毒基因启动子的序列结构特点和活性之间的关系,首先基于硫化叶菌质粒pSeSD,将β-半乳糖苷酶编码基因lacS克隆到阿拉伯糖启动子araS下游多克隆位点,构建重组表达载体pSeSD-lacS.将pSeSD-lacS转化冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)E233S菌株后的功能分析结果表明,lacS基因成功表达.在此基础上,利用硫化叶菌病毒STSV2衣壳蛋白编码基因ORF37上游500bp的潜在启动子片段P37替换pSeSD-lacS中的araS启动子,构建出新的重组表达质粒pSeSD-P37-lacS,进一步将pSeSD-P37-lacS转化E233S菌株进行启动子活性分析.β-半乳糖苷酶酶活结果显示,诱导后araS启动子酶活为14 345.7±422.3 mU,P37酶活为13 723.1±370.9 mU,表明P37片段具有启动子功能,而且活性与araS启动子相当.序列分析也显示,P37具有与硫化叶菌基因启动子类似的基础序列元件initiator、TATA-box及BRE等.本研究表明pSeSD-lacS可作为一个硫化叶菌病毒基因启动子筛选载体,而且高活性的基因启动子可能在STSV2病毒生命过程具有重要的作用.(图4表1参27)     

甲基对硫磷降解菌GFP标记菌株的构建

用Sau3AⅠ酶切甲基对硫磷降解菌DLL 1总DNA ,与BamHⅠ酶切的启动子探针载体 pRobe -GFP酶连 ,转化E .coliDH5α ,在选择性平板LB(Ampr)上从大约 1× 10 4个菌落筛选到 5 0个含启动子片断的阳性克隆 .挑选其中一个阳性克隆 ,将启动子片断克隆到pIJ2 92 5和 pBBR -MCS2上构建成重组质粒 pIJGFP和广宿主标记载体pB BRGFP .然后将 pIJGFP载体上的启动子片断克隆到广宿主载体 pTR10 2上 ,获得第二个广宿主标记载体pTRGFP .将pTRGFP和pBBRGFP通过三亲接合分别标记于DLL 1得到两株标记菌 ,即DLLTR和DLLBR .通过激光共聚焦显微镜观察和软件Lasersharpversion 3.2分析发现 pTRGFP在E .coli中表达很强而在DLL 1中表达很弱 ,而 pBBRGFP正好相反 .图 5表 2参 12     

茶树Ankyrin基因启动子的克隆及其5′UTR内含子功能

为了解启动子在茶树Ankyrin基因(CsAnkyrin)表达调控中的作用,以茶树新品系‘1005’嫩芽为材料,通过染色体步移技术克隆CsAnkyrin基因启动子序列,利用Neural Network Promoter Prediction和PlantCARE在线软件等对启动子序列进行生物信息学分析,将含有内含子和删除内含子的启动子序列(+intron/-intron)分别定向替换pCAMBIA1301表达载体的CaMV35S启动子,构建重组表达载体后分别转化拟南芥,并进行GUS组织化学染色分析.结果显示,克隆得到的CsAnkyrin启动子序列(命名为proAnk)为1 010 bp,含有一个5′UTR(5′Untranslated regions,5′非编码区)内含子.启动子序列除含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、厌氧胁迫应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件.删除5′UTR内含子后的启动子序列能够驱动下游GUS报告基因表达,保留5′UTR内含子的启动子序列不能驱动下游GUS报告基因正常表达,但是RT-PCR实验结果表明5′UTR内含子在转录后没有被切除,而是和GUS基因一起转录产生融合mRNA.本研究表明,proAnk具有诱导型启动子特性,5′UTR内含子对下游基因正常表达具有负调控作用,且可能是在翻译水平上对下游基因表达产生影响.(图7表1参32)     

耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBCl9-amy,并在枯草芽孢杆菌BacillussubtilislA752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基闪自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌B.subtilislA752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性南蛋白质本身的氨基酸序列决定的.     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

中度嗜盐菌Halomonas sp.BYS-1启动子的克隆和测序

提取了中度嗜盐菌Halomonassp.BYS1的基因组DNA,以甲基对硫磷水解酶基因(mpd)为报告基因,以启动子探针pUCmpd为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建了BYS1的启动子文库.通过筛选获得了17个阳性克隆,编号为P1～P17.测定了阳性克隆的甲基对硫磷水解酶(MPH)活性,结果表明,P3中mpd基因的启动子活性最强,它的酶活高达2554.3U/mg,而P17中mpd基因的启动子活性最弱,它的酶活只有68.3U/mg.对P3、P8、P17克隆中的重组质粒的插入片段进行了测序和在线启动子预测.图4表1参17     

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.     

一株多菌灵降解菌NY97-1的分子鉴定及GFP标记

用PCR方法扩增的多菌灵降解菌NY97-1的16SrDNA片段经TA克隆后,进行序列测定和BLAST同源序列比较分析,确定了其分类地位为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus,B.p).经BamHⅠ酶切的启动子探针载体pUC19-gfp与NY97-1基因组DNA的Sau3AⅠ酶切片段酶连,酶连产物转化E.coliDH5a,建立B.p的启动子基因文库.挑选其中的两个强阳性克隆,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组的启动子活性片段F4、F5,构建大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pNW33N-F4-gfp、pNW33N-F5-gfp.通过电转化得到gfp在B.p中的两株标记菌株.在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证明活性片段F4、F5均具有组成型启动子的功能,实现了gfp基因在B.p中组成型表达,且遗传稳定,为今后研究多菌灵降解菌B.p在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下了基础.图3表2参20     

重组人核糖核酸酶抑制因子基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定

人核糖核酸酶抑制因子(Human ribonuclease inhibitor, hRI)是细胞质中的一种酸性糖蛋白,可以与血管生长因子(Angiogenin, Ang)紧密结合从而抑制血管形成.利用全基因组合成法合成针对人核糖核酸酶抑制因子基因(hri)的发夹shRNA序列,亚克隆到siRNA表达载体pKD;重组载体经酶切鉴定后,用脂质体法与报告基因绿色荧光蛋白重组融合的人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri共转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测干扰效果.用Image-Pro plus 4.5软件对绿色荧光照片半定量分析干扰效率.结果表明,荧光显微镜显示B16中表达的绿色荧光被干扰,荧光强度半定量分析干扰效率可达80%以上.成功重组构建了针对hri的siRNA表达载体.图5参9     

水稻arf1基因3′-UTR片段的克隆和验证

终止子是一段位于基因编码之后的序列,作为一种调控信号调控DNA的转录终止和RNA的释放,在基因工程技术应用中通常被构建在目的基因下游,用以调控基因的转录和表达.现有常用的终止子很少,克隆和验证新的终止子是植物基因工程技术发展的需要.通过生物信息学分析和Realtime-PCR表达验证,筛选出候选基因腺苷酸核糖基化作用因子(Similar to ADP-ribosylation factor1,arf1)基因,克隆了水稻arf1基因3′-UTR.结果显示,所克隆3′-UTR片段含有8个多聚信号元件和4个UE片段.将3′-UTR与gus基因融合后分别与玉米泛素启动子Ubiquitin和花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子35S连接构建植物表达载体验证3′-UTR调控表达效果.烟草瞬时表达显示3′-UTR融合的gus基因在35S和Ubi启动子驱动下,在烟草叶片中能正常表达;3′-UTR调控下的gus基因在水稻根、茎、叶、花和种子中均可稳定表达,且表达量与T-Nos终止子相当.本研究表明所克隆的3′-UTR可替代T-nos终止子,可为植物基因工程技术的应用提供新的调控元件.(图5表3参29)     

豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.图3表1参20     

β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19     

纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定

利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得了纳豆激酶成熟肽基因(NK),从而构建了大肠杆菌表达质粒NK/pTWIN1,NK/PET32a及NK/PML-c2x,经分别转化宿主菌ER2566,BL21和ER2566,获得了转纳豆激酶基因重组菌.结果表明,NK/pTWIN1-ER2566和NK/PET32a-BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高.本研究选用NK/pTWIN1-ER2566作为表达菌株,对其进行发酵表达.SDS-PAGE显示,目的蛋白约占菌体总蛋白的36%,该蛋白是以包涵体形式存在的.包涵体经收集、蛋白变性及复性,并经过SP Sepharose分离纯化,得到了纯化的纳豆激酶蛋白,琼脂糖-纤维蛋白平板法测出1mg纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于600u尿激酶.本文从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为利用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础.图5表1参11     

两种启动子对聚γ-谷氨酸降解酶基因在地衣芽胞杆菌中的加强表达效果

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.比较了蔗糖诱导的枯草芽胞杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)启动子和地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因启动子对γ-PGA降解酶基因ywtD在地衣芽胞杆菌中加强表达的影响.分别用SacB基因启动子和α-淀粉酶启动子构建了穿梭表达载体pHY300-SYT和pHY300-PYT,通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组子SYT和PYT.酶活测定结果显示SYT和PYT中γ-PGA降解酶基因ywtD得到加强表达,摇瓶发酵结果显示两个重组菌株的γ-PGA相对分子质量都由1 000 000~1 200 000降低为800 000~900 000,PYT的γ-PGA产量较对照菌株PLK提高了33%,由13.50 g L-1提高到17.97 g L-1,而SYT的γ-PGA产量则降低为10.85 g L-1.因此,α-淀粉酶启动子更适合于在地衣芽胞杆菌WX-02菌株中表达γ-PGA降解酶基因,从而获得高产低分子量γ-PGA的工程菌.     

绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌

用枯草芽孢杆菌168菌株rpsD基因的启动子替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2菌株中,筛选获得遗传稳定性好且具有良好发光表型的标记菌株BS-2-gfp.该标记菌株在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导,接菌50d后仍能在其体内分离到标记菌株.图5参17     

促进氰钴胺素转化为腺苷钴胺素的基因表达与鉴定

辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12.     

矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BSMTcDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBSMT1(GenBank No.AA0501)和phBSMT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在Gen-Bank登录号为DQ494491,命名为phBSMT3.构建的BSMT3 cDNA的原核表达质粒pGBSMT转化BL21(DE3)E.coli,获得的重组菌株经0.01mol/LIPTG诱导后得到正确表达的GST-BSMT融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BSMT在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24     

拟南芥SHI基因在烟草中的表达和矮化、延迟开花的烟草植株的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥基因组DNA中克隆了拟南芥SHOTINTERNODS(SHI)基因,并进行了序列测定.以载体pBI121为基本骨架构建了SHI的植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105.通过农杆菌介导的叶盘法将拟南芥SHI基因转入烟草.PCR和RT-PCR检测证明,拟南芥SHI基因已整合到烟草基因组中并得以表达,获得了矮化、延迟开花的烟草植株.图5参12     

细菌二氯甲烷脱氯酶基因对拟南芥的转化

卤代烷烃是一类很普遍的环境污染物 ,在工业生产中常伴随着废气废物释放出来 ,严重污染土壤及地下水 ,并且严重破坏臭氧层 .在此类污染物含量较高的土壤中分离出一些细菌 ,它们能以卤代烷烃为唯一碳源进行生长 ,且将这些有毒废物分解成无毒的化合物 .我们曾经将细菌卤代烷烃脱卤酶基因克隆到拟南芥中并得到高效表达[1] .Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ和Ｈｙ ｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属的细菌能利用二氯甲烷作为唯一碳源进行生长[5] ,其代谢过程如图 1.其中参与反应的关键酶是二氯甲烷脱氯酶 ,此酶属于谷胱甘肽转移酶类 ,在脱ＣＩ时 ,先…