冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达载体的构建及鉴定

为构建携带冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)的过表达载体,首先从4℃条件下冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的c DNA序列,然后扩增CIRP基因的编码区,将其克隆到真核表达载体p Lenti6/V5中,酶切鉴定并测序.将克隆成功的质粒转染HEK293T细胞,用Western blot检测CIRP的表达水平.成功扩增CIRP编码区,并将其克隆至载体p Lenti6/V5中;当将CIRP过表达载体转染HEK293T细胞后,Western blot检测结果显示CIRP蛋白表达水平明显增加(P<0.01).本研究成功构建了CIRP过表达载体,为进一步研究CIRP的作用机制提供了基础工具.     

重组BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白CIRP多克隆抗体的制备与鉴定

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是第一种在哺乳动物细胞中被发现的冷休克蛋白,伴随着细胞冷应激过程过量表达.为进一步研究冷诱导RNA结合蛋白CIRP的生物学功能,构建重组BALB/C鼠CIRP的原核表达载体,重组BALB/C鼠CIRP蛋白经NI-NTA亲和树脂纯化后免疫獭兔制备抗CIRP多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot检测抗体效价和抗原特异性.本实验成功构建了CIRP的原核表达载体,在E coli XL-1-blue得到了高效表达,利用原核表达包涵体蛋白免疫獭兔获得了高效价的CIRP多克隆抗体,该抗体能识别肝脏和睾丸中天然的CIRP蛋白.图5参14     

不同强度冷应激对大鼠肌肉、脾脏和肝脏中HSP70表达的影响

通过两个低温温度段对健康Wistar大鼠进行冷应激试验,利用免疫印迹技术检验肌肉、脾脏和肝脏中HSP70表达的相对变化情况,探讨不同时间和强度冷应激条件下,3种组织中HSP70表达的情况以及通过HSP70表达量的变化看是否可以将其作为评估冷应激的指标.正常饲养的大鼠环境温度为(20±1)℃,而实验组大鼠分别在(0±1)℃和(10±1)℃环境下进行低温冷应激,然后在冷应激后不同时间宰杀取组织,利用Western-blotting检测HSP70的表达量.结果表明:(1)在(0±1)℃急性冷应激条件下,随着冷应激时间的延长,肌肉和脾脏中HSP70的表达持续增加,与对照组(CK)相比,差异显著(P<0.05);(2)在(10±1)℃慢性冷应激条件下,仅1wk肌肉组中HSP70的表达增加(P<0.05),其它情况下各组织中HSP70的表达与CK相比无显著差异(P>0.05).上述结果说明,相应强度的冷应激可以诱导机体的HSP70表达,并且随时间延长,HSP70的表达增加,可以考虑将HSP70作为监测大鼠应激的指标.图1表2参14     

不同强度冷应激下仔猪淋巴细胞HSP70 mRNA的转录规律

采用实时荧光定量PCR技术检测仔猪血液淋巴细胞HSP70 mRNA的转录量,探讨不同冷应激强度对淋巴细胞HSP70 mRNA转录量的影响.结果表明,仔猪在-10~-4℃冷暴露0.5h,淋巴细胞HSP70 mRNA的转录量迅速升高(P<0.05),并一直保持高水平至6h(P<0.05),随后下降,冷暴露结束后24h恢复正常.在4~10℃冷暴露前后,淋巴细胞HSP70 mRNA转录量无明显变化(P>0.05).结果提示,冷暴露温度越低,淋巴细胞中HSP70 mRNA转录越迅速,但冷暴露结束进入常温后HSP70 mRNA转录水平再次升高的时间延后;HSP70 mRNA转录呈现规律性变化,可以考虑把HSP70 mRNA优先作为评估不同冷应激的客观指标.表1图1参14     

BALB／C鼠睾丸组织中冷诱导RNA结合蛋白的cDNA克隆与序列分析

冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)在多种冷应激细胞(包括重组中国仓鼠卵巢细胞)中被发现.迄今为止,冷应激对活体生物基凶表达的影响还未见报道.和细胞相比,生物体具有更加复杂的冷应激调节机制.本研究以冷处理的BALB/C鼠为实验动物,从其睾丸组织巾克隆出了CIRP的cDNA.结果表明,CIRP在生物体中能够被低温诱导,可能防止生物体遭受冷损伤.根据克隆的cDNA所推测的氨基酸序列与GenBank上公布的小鼠、大鼠、人类、牛蛙、美西螈、非洲爪蟾胚胎细胞和卵母细胞的CIRP氨基酸序列同源性分别为100%、99.40%、95.5%、67.4%、58.4%、76.9%和79.1%.这表明CIRP在生物进化过程中是高度保守的,可能具有多种生理功能.因此,这一研究将为探索人类和动物冷应激分子机制创立系统试验模型和奠定新的实践基础.图5参14     

急性冷暴露对仔猪血浆中IL-2、IL-6、ACTH和皮质醇水平的影响

为了探讨急性冷应激对仔猪免疫系统的影响,本试验将18头45 d"约克夏"仔猪随机分成常温对照组(Control,C)、冷暴露组(Cold exposure,CE)和冷暴露并阻断糖皮质激素受体组(Cold exposure+RU486,CER).常温组在18～20 ℃、冷暴露各组在4～8℃环境下分栏饲养.冷暴露时间持续12 h,在冷暴露开始后的第0、1、3、6、9、12 h六个时间点对18头仔猪采血并分离血浆,分别使用双抗体夹心ELISA法检测各血浆样品的IL-2和IL-6水平,放射免疫分析法测定血浆样品的ACTH和皮质醇水平.结果显示:单纯冷暴露组IL-2水平和IL-6水平在冷暴露6 h时明显升高(P<0.01),ACTH水平在各时间点均明显降低(P<0.01),而Cortisol水平仅在冷暴露3 h时明显升高(P<0.01),IL-2与IL-6的水平呈强相关(r=0.959 5),ACTH与IL-2的水平呈巾等强度负相关(r=-0.435 9)、与IL-6的水平呈弱的负相关,皮质醇与IL-2的水平呈弱的负相关、与IL-6的水平呈中等强度负相关(r=-0.447 8);受体阻断组IL-2在冷暴露6h、9 h和12 h时均明显升高(P<0.01),IL-6在冷暴露6 h明显升高(P<0.01),ACTH在冷暴露各时间点均明显降低(P<0.01),IL-2和IL-6水平呈中等相关(r=0.416 1),ACTH与IL-2、IL-6的水平均呈强负相关(r=-0.676 5/-0.717 4),皮质醇与IL-2、IL-6均呈弱负相关.上述结果表明,急性冷暴露能使IL-2、IL-6及皮质醇的分泌增强,且阻断糖皮质激素受体会导致IL-2和IL-6之间以及ACTH与IL-2/IL-6之间的相关性改变.图1参21     

冷应激对健康雏鸡某些内分泌活动的影响

以罗曼雄性雏鸡为试验对象,研究5d和10d龄健康雏鸡在低于正常饲养温度条件下,在一定时间内机体某些代谢激素的变化规律,结果表明：（1）5d龄雏鸡在两种低温情况下,血清三碘甲腺原氨酸（T3）变化显著,在冷应激最初几h内,T3先下降,至6h（15±1℃）和12h（10±1℃）又升高;血清四碘甲腺原氨酸（T4）变化不明显,在10±1℃情况下,在12h时显著降低;胰岛素（Ins）在两种低温情况下,均于2h时显著升高,而后呈波动性变化,（2）10d龄雏鸡在15℃±1℃条件下,T3在0．5～3h显著下降,至6h回升;T4在2h时显著升高（P＜0．05）;Ins在2h时升高（P＞0．05）,但3h时显著降低,而后又回升（3）血清皮质醇浓度均于冷应激后2h时有所升高,但差异不显著,而后呈波动性变化．     

冷应激对断乳仔猪ACTH及皮质醇的影响

断乳仔猪在-3~3℃低温条件下冷暴露24h,然后在15~18℃室温条件下恢复,检测血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇的动态变化.结果表明,仔猪血浆中ACTH和皮质醇含量随冷暴露时间延长而逐渐升高,冷应激6h时,ACTH含量高于冷应激前的水平(P<0.05);冷应激12h时,ACTH和皮质醇含量与冷应激前比较均有极显著升高(P<0.01);冷应激24h时,两激素含量与冷应激前无显著差异.终止冷暴露后0.5h,ACTH和皮质醇含量均高于冷应激前水平(P<0.05,P<0.01);3h时两激素水平基本恢复正常,但6h时两激素水平再次升高(P<0.01),呈波动性变化.表1参10     

播娘蒿耐寒基因DsKIN1的克隆、序列分析及冷诱导表达分析

播娘蒿是极端耐寒的冷诱导植物,研究其低温胁迫下的冷响应基因对于揭示其抗寒性具有重要意义.根据拟南芥At KIN1和At KIN2同源比对,设计同源引物进行播娘蒿KIN基因克隆,通过RACE技术克隆得到Ds KIN1基因,利用Vector NTI11.5软件对其进行序列分析,采用Realtime-PCR测定Ds CBF1、Ds CBF2、Ds COR和Ds KIN1基因在不同处理方式[整株低温处理、同一植株局部低温处理和局部未受低温处理(两部分植株)]下各时间段(0.2 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h)的表达,采用String数据库预测分析与Ds KIN1相互作用的蛋白.结果显示,Ds KIN1基因序列全长为462 bp,开放阅读框ORF长度为198 bp,编码66个氨基酸,分子量(Mr)为6.61×10~3,理论等电点为9.10,亲水性好.播娘蒿Ds CBF1和Ds CBF2在0.2 h开始表达,在2 h达到最大,随后下降.在冷诱导0.2 h后,Ds CBF调控的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1基因开始表达,均呈现上调的趋势.整株、局部冷诱导植株与同一植株上未受低温胁迫部位的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1表达模式类似.此外发现与Ds KIN1相互作用的蛋白大部分为低温诱导蛋白、盐和渗透压胁迫响应的信号蛋白、与渗透调节有关的家族蛋白、RING-H2锌指蛋白2B以及未知蛋白等.本研究说明播娘蒿局部冷诱导时,冷信号可进行传递,使未受冷诱导部位获得耐寒性能.     

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)与卵清白蛋白(OVA)联合染毒对小鼠肺脏和脾脏组织氧化应激的作用

为研究邻苯二甲酸二丁酯(dibutylphthalate,DBP)单独染毒及与卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)联合染毒对小鼠肺脏和脾脏组织氧化应激的作用,将BALB/c小鼠随机分为8组:(1)未处理对照组(生理盐水组);(2)0.5mg·kg-1DBP染毒组;(3)5.0mg·kg-1DBP染毒组;(4)50mg·kg-1DBP染毒组;(5)1.67mg·kg-1OVA单独染毒组;(6)0.5mg·kg-1DBP与1.67mg·kg-1OVA联合染毒组;(7)5.0mg·kg-1DBP与1.67mg·kg-1OVA联合染毒组;(8)50mg·kg-1DBP与1.67mg·kg-1OVA联合染毒组。未处理对照组和DBP染毒组每天按体质量给予生理盐水和DBP灌胃。2周后,测定肺脏组织活性氧物种(ROS)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量以及脾脏组织ROS、GSH含量。结果显示,联合染毒组相较于其他组的肺脏组织各指标均有不同的显著性差异(P<0.05),联合染毒组的脾脏组织中ROS含量较其他组有显著差异(P<0.05),而GSH含量无统计学意义(P>0.05)。结果说明,DBP与OVA联合染毒能够增强肺脏组织的氧化应激作用,对于脾脏组织的氧化应激作用不明显;DBP在联合染毒中显示一定免疫佐剂效应。     

不同生态下云南稻核心种质孕穗期耐冷性状的表型多样性差异

以504份云南地方稻核心种质为材料,在昆明自然低温平均18℃(冷害)和新平27℃(正常)条件下进行孕穗期耐冷性状的表犁多样性生态差异分析.结果表明:(1)在3种生态环境下,云南稻核心种质11个耐冷性状的平均值、标准差、变异系数等参数存在一定差异,总趋势呈现籼稻(Indica)不同环境间这3个特征值差异较粳稻(Japonica)明显;弱耐冷系统群差异较强耐冷系统群明显.(2)不同环境间11个耐冷性状Shannon-weaver遗传多样性指数存在明显差异,体现为正常环境高于冷害环境,粳稻(Japonica)高于籼稻(Indica),强耐冷材料高于弱耐冷材料.这种差异主要由剑叶长、穗颈长、穗下节长、1～2节长、穗长、主穗实粒数和结实率等7个耐冷性状差异所致.     

SO2长期吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响

采用Affymetrix的基因芯片(RAE230A)技术,研究了SO2长期动态吸入(14mg/m3,1h/d,共30d)后大鼠肺组织基因表达谱的改变.结果表明,与对照组(CK)相比,SO2长期吸入后大鼠肺组织表达上调的基因有173个,其中包括79个已知基因和94个新基因,而表达下调的基因有85个,其中包括46个已知基因和39个新基因.表明:(1)长期吸入SO2的大鼠肺基因表达谱与其CK相比,表达有差异的基因涉及到脂肪酸代谢、免疫、炎症、氧化应激、原癌基因、肿瘤抑制基因和细胞外基质等,表明低剂量长期吸入SO2在体内的机理非常复杂;(2)SO2高剂量短期吸入与低剂量长期吸入后,大鼠肺组织基因表达谱的改变很不一致,表明二者在体内的作用机理不同;(3)SO2可引起多种基因的表达发生改变,这意味着多种基因的表达是易变的、不稳定的,在肺组织中可能存在着SO2诱发的表达不稳定型基因组.表1参19     

Influence of hypothyroidism on oxidative stress,c-Fos expression,cell cycle,and apoptosis in rats testes

The molecular basis of male reproduction for cross-regulation between androgen and thyroid hormone axes is still rudimentary. This study aims to define a possible mechanism of hypothyroidism-induced reproductive influence with respect to sex hormone, mineral, sperm motility, oxidative stress, c-Fos expression, cell cycle, and apoptosis in rat testes. The Wistar rats were randomly divided into control group (NS) and hypothyroidism group [1 ml/100g BW/day, 0.1% propylthiouracil (PTU)] by intragastric gavage for 60 days. Blood samples were collected to measure the serum levels. The epididymis was excised to measure sperm motility and testes were excised to measure mineral, oxidative stress, c-Fos expression, cell cycle, and apoptosis. After 60 days, body weight, relative testes weight, triiodothyronine, and total thyroxine were all significantly decreased, whereas thyroid stimulating hormone was increased in the hypothyroidism group. A significant increase in sex hormone level of estradiol (E2) and significant decreases in testosterone (T) and T/E2 ratio were observed following PTU treatment. And sperm quality was also significantly changed. There were significant decreases in the contents of calcium (Ca²⁺) and zinc (Zn²⁺). On the other hand, malondialdehyde and hydrogen peroxide contents significantly increased, whereas the activity of superoxide dismutase, catalase and nitric oxide synthase and nitric oxide content significantly decreased in hypothyroid rats. The mRNA and protein expressions of c-Fos decreased significantly. The cell percentage in G0/G1 phase increased significantly, whereas decreased significantly in S and G2/M phases. Also, a significant increase in testicular cell apoptosis was observed in hypothyroid-treated rats. These results suggested that hypothyroidism could affect reproductive function in the form of changed sex hormone levels, sperm motility and testicular Ca²⁺ and Zn²⁺, and enhanced oxidative stress leading to c-Fos abnormal expression and increased apoptosis.     

低温胁迫下香菇基因表达差异研究

香菇为变温结实型担子菌,为探讨低温胁迫诱导香菇子实体形成的分子机理,应用mRNA差异显示技术对低温胁迫下香菇菌丝体基因表达差异进行了比较.电泳差异展示结果表明,低温胁迫前后基因表达在数量水平和质量水平上都存在显著差异,数量水平的差异表现为低温胁迫过程中表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)增强表达或减弱表达;质量水平上的差异表现为低温胁迫使部分ESTs特异诱导表达或沉默表达.差异ESTs的类型比较和多态性分析发现,低温胁迫处理6~12h可能是诱发香菇原基发生的关键时段.本文还对显著差异表达的基因片段进行序列分析和Northern杂交验证,初步讨论了低温胁迫时间在调控香菇子实体发生中的作用.图4表2参13     

气管滴注大气细颗粒物对大鼠心脏的急性毒性及其机制研究

为探讨大气细颗粒物(PM2.5)对大鼠心脏的急性毒性及其机制,将28只健康雄性Wistar大鼠随机分为空白膜对照组、7.5mg·kg-1、15mg·kg-1和30mg·kg-1剂量组.细颗粒物采用一次性咽喉部气管滴注染毒,24h后处死动物.分别于染毒30min、1h和24h后测定大鼠心电图,采用间接免疫荧光化学方法测定大鼠心脏缝隙连接蛋白Cx43的分布,采用免疫印迹法(Western blot)测定连接蛋白Cx43的表达;光镜下观察心脏的组织病理学改变.结果发现,染毒30min后,各组大鼠心律失常发生率均高于基础测量时,染毒1h后对照组恢复正常心律,而颗粒物染毒组仍显示异常心律,与对照组相比,15mg·kg-1和30mg·kg-1剂量组大鼠心律失常发生频率显著增加(p<0.05),染毒24h后各组均恢复正常心律.Cx43免疫荧光结果显示,染毒24h后,15mg·kg-1和30mg·kg-1剂量组大鼠心肌Cx43荧光强度显著降低(p<0.01);Western blot测定结果显示,随着PM2.5染毒剂量的增加,心肌组织Cx43表达逐渐减少,15mg·kg-1和30mg·kg-1剂量组Cx43蛋白水平分别为对照的57%和51%,与对照组相比,差异具有显著性(p<0.01);病理切片结果发现,对照组和各剂量均可见到心肌横纹,心肌排列正常,横纹清晰,未见明显心肌细胞萎缩、变性,亦未见炎细胞浸润.本次研究结果表明,大气PM2.5可引起健康Wistar大鼠心律异常的发生,心肌组织Cx43分布和表达的异常可能是其机制之一.     

Evaluation of reproductive and developmental toxicity of cypermethrin in male albino rats

The ever-increasing use of pesticides in the agricultural and public health has become a major cause of sterility in human and various other animals particularly in males. This study was sought to screen the toxic impacts of cypermethrin (synthetic pyrethroid) on reproduction and development. Twenty-four Wistar male rats divided into four groups were orally administered cypermethrin of daily doses 50, 75, or 100 mg?kg^?1 bwt per day for 45 days; and for developmental toxicity, 12 female rats were separated into two groups. Maternal rats (experimental) were administered cypermethrin (100?mg?kg^?1) by gavage daily from 6th to 17th day of gestation, and the control group was dosed only vehicle (olive oil). The body weights, fertility index, biochemical, enzymatic, hormonal, and histopathological parameters were the criteria used to evaluate the toxicity of cypermethrin. Study showed significant decline in the weight of testes, epididymises, seminal vesicles, and ventral prostate, and reduction in sperm counts both in epididymises and testes in chemical-treated animals. Pre- and post- fertility test showed 50%, 80%, and 100% negative results after treatment. A significant degenerative reduction in testicular glycogen and sialic acid was also noted. In contrast, protein and cholesterol levels of testes were significantly increased. In addition, acid phosphatase activity was significantly increased, while alkaline phosphatase, testosterone, leutinizing hormone (LH), and follicle stimulating hormone (FSH) levels were diminished. Histology of testes showed degenerative changes in seminiferous tubules. Cypermethrin exposure during gestation produced adverse effects markedly in females and fetuses.     

香蕉MaPFK基因家族鉴定、MaPFK3克隆和表达

为研究香蕉中MaPFK基因的功能和生物学特性,采用生物信息学分析法对香蕉A基因组的MaPFK基因家族成员进行鉴定、蛋白特性分析、分子进化树分析、FPKM值分析,同时以‘天宝蕉’为材料,通过RT-PCR技术克隆MaPFK3基因,进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术进行低温胁迫下的表达分析.结果表明,MaPFK家族包含12个成员,分子进化树分析可分为3类,FPKM值分析表明MaPFK成员在13、4、0℃不同低温胁迫下有不同程度的上调或下调表达.采用RT-PCR技术克隆了MaPFK3,其基因编码区长1 617 bp,预测编码538个氨基酸,MaPFK3编码蛋白属于PFK超家族,是不稳定的酸性亲水蛋白,无信号肽,亚细胞预测定位于细胞质;MaPFK3启动子顺式作用元件预测分析结果显示,MaPFK3启动子含有光响应、激素响应以及与逆境胁迫相关的作用元件.qRT-PCR分析结果显示,香蕉MaPFK3基因的表达具有组织差异性,且表达量为叶片>假茎>根;低温胁迫引起‘天宝蕉’中MaPFK3基因下调表达,在13、4、0℃不同低温胁迫下,MaPFK3的表达量为13℃<4℃<0℃.本研究表明MaPFK基因家族成员能在香蕉应对低温胁迫的过程中发挥着重要作用.(图11表2参32)     

氯化二丁基锡对小鼠外周血液中睾丸酮和雌二醇含量的影响

用放射免疫法分别测定了DBTCl对妊娠d6雌小鼠和成年雄小鼠外周血液中雌二醇和睾丸酮水平的影响.每天按小鼠体重一次腹腔注射0.025～0.400μg/kgd-1DBTCl，共染毒7d.实验条件为(22±2)℃和光暗=12h12h.结果表明，处理组睾丸酮和雌二醇的含量随处理剂量的增加而增加，当w（DBTCl）≥0.05μg/kg时，二者呈明显的剂量-效应关系.雌二醇含量的增加比睾丸酮更为显著CK雄性小鼠睾丸酮浓度为（2.88±0.72）ng/mL，在0.40μg/kg剂量组达到(9.95±2.5)μg/mL时，约为CK的3.5倍；而CK和0.40ng/kg剂量组妊娠小鼠雌二醇浓度分别为(30.32±5.43)ng/mL和(287.57±51.13)ng/mL，相差约9.5倍.文中还就DBTCl对小鼠血液中激素含量的影响机理进行了初步探讨.图1表2参20