活性污泥中的腐殖酸对实时荧光定量PCR的影响

活性污泥基因组中的腐殖酸会影响实时荧光定量PCR检测的准确性.本研究采用抽提基因组前腐殖酸去除试剂盒、抽提基因组后腐殖酸去除试剂盒、抽提基因组前后共同去除试剂盒3种不同的方法,去除活性污泥基因组中的腐殖酸,经过PCR和实时荧光定量PCR方法的验证找出腐殖酸去除的最适方法;通过DNA酶Ⅰ消化基因组DNA保留杂质腐殖酸,向其中掺入已知浓度的总细菌质粒,5个浓度10倍梯度稀释10 ng·μL~(-1)的定量模板,探究腐殖酸和梯度稀释模板对活性污泥总细菌实时荧光定量PCR的影响.结果显示,在不同处理组中,通过反复洗脱的方式在基因组抽提前去除活性污泥中的腐殖酸,DNA的得率(162.46 ng·μL~(-1))最多,A260/230值为1.34,A260/280值为1.80,腐殖酸的残留最少;去除腐殖酸后外加内标质粒组,梯度稀释10 ng·μL~(-1)模板100倍及以上,腐殖酸的抑制效应显著降低后保持不变(p0.05),100倍以内变化不显著(p0.05);抽提前去除腐殖酸组进行实时荧光定量PCR的抑制效率为6.16%,显著低于对照组的72.68%(p0.05).研究表明,抽提前去除活性污泥腐殖酸,抽提后将基因组模板稀释100倍可显著降低活性污泥实时荧光定量PCR的抑制效率,提高定量结果的准确性.     

核分离-滤膜洗脱技术同时检测植物DNASSB与DSB

采用核分离 -滤膜洗脱技术 ,将分离的细胞核在微孔滤膜上裂解后相继用中性溶液和碱性溶液洗脱 ,研究了⁶⁰Co- γ辐射引发的大麦种胚细胞 DNA断裂 .结果显示 ,50 Gy的 ⁶⁰Co- γ辐射主要引发 DNA单链断裂 (DNA SSB) ;50～100Gy的辐射引发的DNA断裂包括单链断裂 (SSB)与双链断裂 (DSB) ;当辐射剂量大于 100Gy时 ,DNA断裂的增加部分则以 DSB为主 .所用的实验方法适用于质地致密的植物材料并可在一次实验中同时检测 DNA的 SSB与 DSB,为植物细胞的 DNA链断裂作为生物标志物应用于环境诱变因子监测提供了基础 .     

吸烟与非吸烟肺癌患者中P53基因突变的检测

P53基因定位于人类第17号染色体的短臂,野生型P53基因是肿瘤抑制基因。这一基因正成为研究人类肿瘤DNA的主要目标。作者运用聚合酶链反应－单链构象多态性技术（PCR－SSCP）,研究了45例石蜡包埋的肺癌组织标本中肿瘤抑制基因P53基因突变,结果发现在P53基因的第5～8外显子中共检测到19例P53基因突变的样本,检出率为42.2％,并且发现吸烟的肺癌患者中P53基因突变的检出频率明显高于非吸烟的肺癌患者。     

水环境中大肠杆菌PCR快速检测体系的研究

应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术,建立能在12 h内快速检测大肠杆菌的体系.把环境水样过滤浓缩后,将截留在膜上的细菌直接或8 h增菌后提取DNA模板,以大肠杆菌Uid A基因设计引物,经过PCR扩增、凝胶电泳检测,水环境样品在不增菌条件下和增菌条件下检出限分别为1.52×104个/L,1个/L.与滤膜法比较,PCR法时间缩短、灵敏度和准确度提高,适宜于水环境中大肠杆菌的快速检测.     

甲醛致DNA断裂作用的机制及修复的研究

应用单细胞凝胶电泳技术研究了甲醛致DNA断裂作用、作用机制以及断裂的修复.结果表明,甲醛在低浓度下可以诱导DNA的断裂(P<0.01);该断裂作用可以显著地被羟基自由基(·OH)清除剂甘露醇和二甲基亚砜抑制(P<0.01),以及受到超氧阴离子自由基(O·-2)清除剂超氧化物歧化酶(SOD)显著抑制(P<0.01),但其抑制效果要弱于甘露醇和二甲基亚砜.甲醛引起DNA断裂作用是通过活性氧自由基介导的,且在90min时基本上可被完全修复.     

一般性问题

XSOZ 9903418用PCR技术检测生物硝化池污水中硝化细菌(Nitrobacteria)的研究/明镇寰…(浙江大学西溪校区生命科学学院)//浙江大学学报(理学版)/浙江大学一1999,26(2)一83一86 环信N一27 从生物硝化池污水水样中分离了硝化细菌DNA,以其为模板,针对其16SrRNA基因及23SrRNA基因而设计合成了两对引物并分别进行了PCR扩增,扩增产物的2%琼脂糖凝胶电泳结果显示,硝化细菌DNA模板得到了特异性扩增。参照分子量标准(Marker)的电泳结果,被扩增的DNA条带大小分别约为4oobp和73obp。实验结果表明PCR技术可用于污水中硝化细菌的快速检测。…     

生物硝化池污水中硝化细菌的快速定量研究

实验采用聚合酶链式反应（PCR）技术与最大几率数法（MPN）相结合的MPN－PCR法对生物硝化池污水中的硝化细菌进行快速定量。所用的一对PCR引物是在对硝化细菌的16SrRNA基因进行系统比较的基础上设计合成的，可以扩增出大小为388bp的DNA片段。以从生物硝化池污水中抽提的含硝化细菌DNA的混合DNA为模板，进行PCR扩增并确定合适的扩增条件。运用MPN－PCR法进行定量检测的整个过程可在几小时之内完成。     

北京市大气细颗粒物的遗传和非遗传毒性研究

用胞质阻断微核试验与单细胞凝胶电泳法检测北京市大气PM_2.5无机提取物与有机提取物对Balb/c 3T3细胞微核形成与DNA链断裂的影响;通过划痕染料示踪技术(SL/DT)观察PM_2.5无机提取物与有机提取物对Balb/c3T3细胞间通讯的影响.发现PM_2.5有机提取物可引起双核微核细胞率显著增加(P<0.01)及导致慧星细胞率和DNA迁移长度显著增加(P<0.01);PM_2.5有机提取物引起细胞间通讯的抑制; PM_2.5无机提取物未见明显毒作用.结果表明,PM_2.5可引起染色体损伤和原发性DNA损伤,抑制细胞间通讯,其毒作用主要由其有机成分引起.     

DNA碱解旋速率法及其在DNA损伤研究中的应用

对DNA碱解旋速率法的细胞DNA经碱解旋后通过羟基磷灰石(HA)柱分离单、双链DNA时的洗脱次数、温度以及DNA回收效果进行了研究。结果表明,用0.125mol/L和0.25mol/L磷酸钾缓冲液各3ml,先后各洗脱一次,即可满足细胞DNA链断裂研究的要求。洗脱双链DNA时的温度为60℃即可。~3H-DNA与细胞其它组分一起通过HA柱时,~3H-DNA的回收率达94％左右。应用这一技术对电离辐射引起的中国田鼠肺细胞和小鼠脾细胞DNA单链断裂损伤与照射剂量的关系进行了探讨。结果表明,DNA单链断裂程度与照射剂量呈正相关。     

PCR技术检测水中轮状病毒的研究进展

聚合酶链式反应,即PCR(polymerase chain reaction)技术,是一种快速扩增DNA或cDNA序列的方法.水环境中的轮状病毒是导致世界范围内婴幼儿腹泻的主要原因,严重危害着水质安全和人类健康.建立和完善水中轮状病毒灵敏、快速的检测方法对预防和控制水体疾病的暴发具有重要的意义.随着分子生物学技术的发展,PCR及其衍生技术因其具有高度灵敏性、特异性和准确性等特点,成为检测水中轮状病毒最常用的方法.本文综述了利用RCR及其衍生技术,包括逆转录聚合酶链式反应、逆转录半巢式和巢式聚合酶链式反应、多重逆转录聚合酶链式反应、免疫聚合酶链式反应、与免疫磁珠分离相结合的聚合酶链式反应、与细胞培养相结合的聚合酶链式反应及实时定量聚合酶链式反应等,检测水环境中轮状病毒的研究进展,并分析了这些PCR技术在检测水环境中轮状病毒时存在的问题及其应用前景.     

水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建

采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进行特异性、稳定性和重复性指标的检验.结果表明,利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.353,R2=0.995);实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在81℃±0.5℃的PCR产物是轮状病毒VP7序列上的特异性产物,表明此标准品是轮状病毒特异性的;同时,所制备的标准品在实时定量PCR检测中具有较大的线性范围(9×100～9×1011 copies/μL,每个反应最低可以检测到9个拷贝数的轮状病毒cDNA,表明利用该标准品进行实时定量PCR分析时具有较高的检测灵敏性;此外,该标准品具有较高的稳定性和重复性(3次独立实验CV值在0.2%～0.9%之间),可长期稳定保存.构建的标准品可用作检测水环境中轮状病毒的实时荧光定量PCR的外标准品.     

PCR-DGGE技术在城市污水化学生物絮凝处理中的特点

通过PCR-DGGE等分子生物学技术可以不经过常规培养直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA,对16Sr DNA V3区进行PCR扩增,结合DGGE(变性梯度凝胶电泳),从而分析活性污泥与生物膜中微生物种群结构.研究证实,活性污泥培养前后微生物种群结构发生很大的改变.同时对2种污水处理工艺中微生物种群结构进行了对比研究,对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨.测定了活性污泥中部分菌种的16S rDNA V3区片段序列,通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)基因库比对,初步确定细菌的属.结果显示,PCR-DGGE结合测序技术是一种完全可行的快速进行环境学样品微生物研究的分析方法.     

Analysis of parental strain DNA fragments existing in GEMs-Fhhh

There were 6 target DNA fragments of the three parental strains existing in the cell of GEMs( genetically engineered microorganism strain) Fhhh measured in this research by PCR(polymerase chain reaction). The determination showed that GEMs Fhhh contained all the 6 target DNA fragments, mnpl, mnp2, lipl, lip2, FLOI and 16S rDNA, and had the molecular genetic stability. Meanwhile the PCR production of each parental strain could only had its target DNA fragments and was different from each other. It may illustrate that the technique of the inter-kingdom protoplast fusion for the construction of GEMs Fhhh through the process of intercellular gene recombination could be used as a reliable bioengineefing technique to create the soecific functional stain for the nollution control.     

降解酚的根瘤菌的研究

对两铢以铺代谢方式降解酚和离体固氮的根瘤菌(代号为:101-3,97-1)的特性进行了研究,其耐酚能力在1200ppm内,五天内能在完全培养基中把300ppm苯酚降解完;在含酚培养基中多次传代后,生长周期加快、产气,而结瘤特性丧失,但离体固氮酶活性比原菌株略有增加。经60ppm的吖啶橙处理后,获得的无质粒菌株,其降解酚的能力和结瘤特性完全消失,TTC(3-苯基-4-氮唑化氯)还原性增加,而革兰氏染色反应、运功性不变。     

Detection of Y chromosome-specific DNA in the plasma and urine of pregnant women using nested polymerase chain reaction

The present study was undertaken to evaluate a nested polymerase chain reaction (PCR) for detection of Y chromosome-specific fetal DNA in maternal plasma and urine of pregnant women during different gestational stages. DNA isolated from plasma and urine samples of 80 pregnant women (between 7 and 40 weeks' gestation) underwent amplification for Y chromosome-specific 198 bp DNA by nested PCR. The postpartum analysis of fetal gender showed that 55 women carried male and 25 female fetuses. Among the 55 women bearing male fetuses, Y chromosome-specific signals were detected in 53 (96%) plasma and 21 (38%) urine samples. Moreover, out of 25 women bearing female fetuses, 3 (12%) and 1 (4%) women had Y chromosome-specific signal in plasma and urine, respectively. Analysis of results with respect to gestational age revealed that there was no significant difference in the detection of Y chromosome-specific DNA between different trimesters in maternal plasma of women bearing male fetuses. These results showed that fetus-specific DNA was detected with high sensitivity (96%) and specificity (88%) in the maternal plasma by nested PCR, and therefore the method could be useful as a non-invasive procedure for fetal sex determination and prenatal diagnosis. Copyright © 2001 John Wiley & Sons, Ltd.     

马粪海胆RAPD反应体系的优化

以马粪海胆为研究对象,从影响RAPD实验结果的4个因素(引物、dNTP、Taq酶、DNA)入手,进行单因素设计,从而寻找最佳的反应浓度,达到最佳的反应效果。优化后4种因素的最佳反应浓度分别为:引物100μmol/L、dNTP 2 500μmol/L、Taq酶2U、DNA稀释80倍。在优化的反应条件下,得到的产物重复性和稳定性都比较不错。     

Molecular evidence of fetal-derived chromosome 21 markers (STRs) in transcervical samples

Transcervical cells (TCCs), collected by flushing or aspiration at 8–13 weeks of gestation, were analysed for the presence of fetal-derived DNA sequences. DNA extracted from maternal peripheral blood, TCC samples, and placental tissue was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) to detect small tandem repeat (STR) markers specific to chromosome 21. STR products of fetal origin could be clearly observed in four TCC samples. TCC samples collected by flushing or aspiration were also analysed by fluorescent in situ hybridization (FISH) using X and Y probes simultaneously: 46,XY cells could be detected in all TCC samples obtained from mothers with male fetuses.     

回灌渗滤液VFA浓度对填埋层甲烷化代谢的影响

处于稳定产甲烷阶段的填埋层具有降解回灌渗滤液有机物的能力,但高浓度渗滤液的主要组分(挥发性脂肪酸(VFA))可能影响填埋层的甲烷化代谢,导致填埋层对回灌渗滤液有机物降解效率恶化.采用实验室模拟填埋柱回灌不同ρ(VFA)模拟渗滤液的方法,研究不同VFA负荷对稳定产甲烷阶段填埋层甲烷化代谢的影响.结果表明:稳定产甲烷填埋层具有处理高ρ(VFA-C)渗滤液的能力,其有机碳的转化能力小于1.0 g/(kg·d);当回灌渗滤液中的ρ(VFA-C)大于14.8g/L(有机负荷为2.2 g/(kg·d))时可抑制填埋层的甲烷化代谢,但这种抑制可随着回灌渗滤液中ρ(VFA-C)的降低而得到解除;为保证填埋层内垃圾的降解,应控制回灌渗滤液的有机负荷不超过1.0g/(k·d).      

红球菌PR-1菌株破乳性能研究

利用乳化剂Span 80配制出一种稳定的煤油-水乳浊液作为模型乳浊液,进而从大港油田废水中筛选出1株破乳能力较强的红球菌PR-1.该菌株培养液在55℃下8h可以使模型乳浊液完全破乳,且在实验条件下比化学破乳剂DGF-01具有更强的破乳活性.研究发现,乳浊液的破乳为线性增长过程,冻融和高压灭菌对其破乳能力没有影响,菌体细胞是破乳的主要活性成分,经超声波破碎及有机溶剂处理后其破乳活性显著降低.菌体表面有很强的疏水性,其对烃的粘附率为84%,碳链长度范围在C₂₇～C₅₄的枝菌酸类物质是保持菌体细胞完整性和疏水性的关键,其对细胞的破乳活性也至关重要.PR-1菌株发酵液用于原油乳状液的破乳具有操作方便,破乳率高,应用面广,无毒无害等优点,且能完全脱出J9-19原油乳状液中的水,因此可作为原油乳状液或油田采出水的破乳剂.