高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用

利用PCR-mediated Technique对酿酒酵母W303-1A金属硫蛋白基因(cup1)进行敲除,获得一株铜离子敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A cup1△),其对Cu2+抑制浓度由1.2 mmol/L降为0.08 mmol/L;以pYX212载体为基本构架,以S.cerevisiae W303-1A cup1△为宿主菌,构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统,并成功表达了绿色荧光蛋白基因(gfp),从而实现了高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用.本研究构建的高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统不仅廉价、安全,而且丰富了酵母的表达系统,同时对微生物的铜抗性机理及生物修复功能的研究具有指导意义.     

马氏甲烷八叠球菌S－6的一个染色体区段的表达、序列分析和结构分析

用一组多克隆抗体对马氏甲烷八叠球菌（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｍａｚｅｉ）Ｓ－６菌株的基因组ＤＮＡ文库进行了筛选．仅选出ｐ６０Ａ克隆能对马氏甲烷八叠球菌中可发生细胞形态学变化菌株的抗血清发生阳性反应．对ｐ６０Ａ克隆的双链ＤＮＡ进行了序列分析．识别出一开式阅读框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅＰ，ＯＲＦＰ）．表达的蛋白是ＯＲＦＰ编码的蛋白的３倍，并得到ＯＲＦＰ蛋白的三聚体，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中表现出整体蛋白的迁移行为．同时，此表达蛋白抗１０％ＳＤＳ，６ｍｏｌ／Ｌ尿素及热处理．基因结构分析表明，ＯＲＦＰ具有与Ｍ．ｂａｒｋｒｉｍｃｒＡ有同源性的核糖体结合位点和一个与甲烷细菌启动子共有序列相似度达７７％的启动子序列．使用参照序列分析表明，由ＯＲＦＰ演绎的氨基酸序列，具有高密度的带电荷的氨基酸和占优势的β－层迭构型．对此表达蛋白作了Ｎｅｕｒｏｓｒｏｒａｃｒａｓｓａ的ｐｏｒｉｎ蛋白抗血清试验，以研究其可能功能．检验了Ｍ．ｍａｚｅｉＳ－６细胞的蔗糖梯度制备物，对此原细胞中的ＯＲＦＰ蛋白作了定位．结果表明，ＯＲＦＰ蛋白可能是一种古细菌Ｐｏｒｉｎ，其在Ｍ．ｍａｚｅｉＳ－６中的表达，可能象大肠杆菌那样与渗透压调节有关．     

不同菌源的微生物对邻苯二甲酸二甲酯生物降解性的比较

从处理石化厂废水的活性污泥中分离出１ 株邻苯二甲酸酯降解菌 Ｆ Ｓ１（ 荧光假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｆ Ｓ１） ,从处理焦化厂废水的活性污泥中分离出２ 株邻苯二甲酸酯降解菌 Ｆ Ｓ２（ 铜绿假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎａｓａ Ｆ Ｓ２） 和 Ｆ Ｓ３（ 短杆菌 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ ． Ｆ Ｓ３） ． 研究了邻苯二甲酸酯降解菌 Ｆ Ｓ１ , Ｆ Ｓ２ 和 Ｆ Ｓ３ 对邻苯二甲酸二甲酯（ Ｄ Ｍ Ｐ） 的最适降解条件,比较了其降解特性． Ｆ Ｓ１ 、 Ｆ Ｓ２ 和 Ｆ Ｓ３ 最适酸度分别为ｐ Ｈ６ ．５ ～８ ．０ 、ｐ Ｈ７ ．０ ～８ ．０ 和ｐ Ｈ７ ．０ ～８ ．０ ,温度为２０ ～３５ ℃、１５ ～３５ ℃和１５ ～３５ ℃．邻苯二甲酸酯降解菌 Ｆ Ｓ１ 、 Ｆ Ｓ２ 和 Ｆ Ｓ３ 对邻苯二甲酸二甲酯的降解的半寿期： Ｆ Ｓ１ ＜ Ｆ Ｓ２ ＜ Ｆ Ｓ３ ,邻苯二甲酸酯降解菌 Ｆ Ｓ１ 是一株高效的邻苯二甲酸二甲酯降解菌     

金黄色葡萄球菌的演相培养及A蛋白的提取

对金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＣｏｗａｎⅠ的培养及Ａ蛋白提取工艺进行了优化研究．结果表明：在培养基中分别增加牛肉膏和蛋白陈的含量，有利于提高菌体生物量及Ａ蛋白的得率；少量酵母浸膏及葡萄糖对生物量及Ａ蛋白得率有促进作用，但当达到一定浓度时则会产生基质抑制作用；恒定培养过程的ｐＨ值有利于Ａ蛋白得率的增加，０．０３（）／ｍｉｎ通气量、搅拌速度２００ｒ／ｍｉｎ是能满足菌体生长的条件．根据Ａ蛋白耐热性强这一特性，采用加热法除去大部分杂质，然后用ＩｇＧ－琼脂糖凝胶亲和层析实现了Ａ蛋白的提纯．     

gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10     

稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建

分别克隆了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因XYL2,构建出重组表达质粒pACT2-xy11和pDR195-xy12,并使其分别转化酿酒酵母受体细胞.酶活测定结果显示,转化子中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主菌中得到活性表达.并将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆,进而构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5.kanR-x12,以期今后通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中,得到稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株.图3表1参15     

乳酸乳球菌SM526产生乳链菌肽的营养调控

自酸泡菜中分离并鉴定了一株产生乳链菌肽的菌株－乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＳＭ５２６。研究了不同种类与浓度的碳源、氮源和磷源对该菌产生乳链菌肽的影响，结果表明乳链菌肽的生物合成受碳源、氮、磷源的调控，蔗糖和磷酸二氢钾分别为其最佳碳源和磷源，大豆蛋白胨和酵母粉为其理想氮源。得用分批培养也链菌肽合成的代谢动力学则表明，乳链菌肽在ＳＭ５２６菌株的指数生长期     

硫酸盐还原菌的生态特性及其应用[综述]

硫酸盐还原菌（ＳＲＢ）是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或者其他氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物质的严格厌养菌．常见属有脱硫弧菌属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）,脱硫肠状菌属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）．因其参与自然界中的多种反应,所以愈来愈得到人们的关注．１　ＳＲＢ的生活环境和条件１．１　ＳＲＢ在环境中的分布［１］自然界中最常见的ＳＲＢ是嗜温的革兰氏阴性、不产芽孢的类型．在淡水及其他含盐量较低的环境中,易分离到革兰氏阳性、产芽孢的菌株．此外,在自然界中存在的还有革兰氏阴性嗜…     

城市生活垃圾中酞酸酯的微生物降解

从酞酸酯生产厂排污沟中分离到４株酞酸酯降解菌，分属镰孢属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐ．）、醇母属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）、不动杆菌属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）、黄单孢菌属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）。在酞酸酯剂量为５０、２５μｇ／ｍＬ水平的纯培养条件下，４株单菌对酞酸酯的降解率达到７２％－７７％，混合菌的降解率还可提高近１０％。在垃圾堆肥中酞酸酯剂量为１９７μｇ／ｇ的水平下，将降解菌回接堆肥后，不动杆菌属和混合菌对酞酸酯的降解率最高，分别达到７２％和６９％。     

纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定

利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得了纳豆激酶成熟肽基因(NK),从而构建了大肠杆菌表达质粒NK/pTWIN1,NK/PET32a及NK/PML-c2x,经分别转化宿主菌ER2566,BL21和ER2566,获得了转纳豆激酶基因重组菌.结果表明,NK/pTWIN1-ER2566和NK/PET32a-BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高.本研究选用NK/pTWIN1-ER2566作为表达菌株,对其进行发酵表达.SDS-PAGE显示,目的蛋白约占菌体总蛋白的36%,该蛋白是以包涵体形式存在的.包涵体经收集、蛋白变性及复性,并经过SP Sepharose分离纯化,得到了纯化的纳豆激酶蛋白,琼脂糖-纤维蛋白平板法测出1mg纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于600u尿激酶.本文从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为利用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础.图5表1参11     

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.     

麻疯树叶绿ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱胞和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列.对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1 368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量(Mr)大小为52.1×103.同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性.RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达.此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能.对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累.上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶.     

顺丁烯二酸异构酶工程菌发酵条件优化

为提高重组大肠杆菌中顺丁烯二酸异构酶表达量,通过正交试验设计,对工程菌的生长条件和目的蛋白可溶表达条件进行优化.采用250 mL三角瓶中装有50 mL(Amp 100 mg L-1)的培养基,分别研究培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉的浓度,培养基pH值以及摇床转速、装液量、接种量等对蛋白可溶表达量的影响.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌最优化培养基为:蛋白胨20 g L-1、酵母浸粉2.5 g L-1、K2HPO4·3H2O 3.0 g L-1、KH2PO4 1.5 g L-1、NaCl 6 g L-1、MgSO43 g L-1,培养基pH调至6.5.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌可溶性表达最优条件为:37℃下培养至D600 nm值为1.0时,添加终浓度为0.05 mmol L-1的IPTG进行诱导,诱导温度37℃,摇床转速220 r min-1,装液量20%,接种量5%,诱导时长为6 h.利用BioFlo 415发酵罐以最优化的培养基和发酵条件对该工程菌进行了3批发酵实验,与摇瓶实验相比,顺丁烯二酸异构酶的表达量提高了近1.5倍,单位发酵液的酶活力由46 U mL-1发酵液提高到78 U mL-1发酵液.以上数据为顺丁烯二酸异构酶重组工程菌的中试发酵奠定了基础.图7表2参17     

杂合抗菌肽LPCB在毕赤酵母中的表达条件优化

为获取能表达具有天然活性的杂合抗菌肽的重组酵母菌,确定其最佳表达条件,将构建好的重组酵母表达载体pPICZα-A-CecropinB(1～10)-Magainin2(1～12)(简称pPICZα-A-CBMA)和pPICZα-A-Lfcin-Pro-CecropinB(简称pPICZα-A-LPCB)经SacⅠ线性化处理,分别电转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,PCR扩增验证,甲醇诱导表达.采用抑菌圈法初步测定产物活性,优化杂合肽LPCB诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度、培养基pH等表达条件,传代检测其质粒稳定性.结果显示,基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-CBMA和P.pastoris X-33/pPICZα-A-LPCB成功构建.表达产物前者抑菌活性微弱,后者抑菌活性良好.杂合肽LPCB的最佳表达条件为:25℃,pH中性培养,每24 h添加0.5%(V/V,φ)甲醇,诱导表达72 h.重组酵母菌pPICZα-A-LPCB在培养超过100代后,未发生质粒丢失.     

表面展示技术在污染环境生物修复中的应用

革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和酵母中已建立多个表面展示短肽和蛋白质的系统.在微生物细胞表面展示外源蛋白对污染环境的生物修复有着重要的意义.展示金属结合蛋白(肽)的微生物可用于污染土壤和工业废水的净化,展示有机磷水解酶的微生物将用于有机磷污染物的脱毒.微生物表面展示技术将成为污染环境生物修复的有效策略.这一技术的研究还是一个新领域,要使其得到应用还有许多问题需要解决. 参38     

用啤酒糟酶解液培养酵母菌产麦角固醇的研究

以麦角固醇质量分数达３％以上的酵母菌株Ｙｓ－５和Ｙｓ－１６为培养菌,进行了用啤酒糟酶解液代替糖蜜培养基发酵生产麦角固醇的实验．结果表明,在最适条件下,添加少量自溶性酵母,酵母菌的麦角固醇产率可提高２０％左右．     

应用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器筛选基因毒性化合物

为了扩展本实验室构建的响应于DNA损伤信号的超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器的检测范围并积累参考数据,为实际应用打下实验基础,本研究对26种与环境及人类生活息息相关的化合物的基因毒性进行了检测,筛选出8种具有基因毒性的化合物,并将其结果与现有微生物检测系统的检测结果进行了对比。结果显示,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器的检测结果与以细菌为宿主细胞的Ames试验或SOS显色法的检测结果的吻合度高于50%,与以酵母为宿主细胞的GSA检测系统的检测结果的吻合度高于85%。以真核生物酵母为宿主的检测系统与以原核生物细胞为宿主的检测系统的结果的差异反映了它们抗胁迫机制的不同。本研究应用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器特异性检测出3种化合物为基因毒性阳性,这3种化合物是代森锰锌、孔雀石绿及丙烯酰胺,均被报道具有潜在致癌性。本研究结果表明,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物传感器可以有效地对环境污染有关的基因毒性化合物进行检测,可以作为其他现有检测系统的补充,应用于环境化学污染的健康风险评价。     

Release of phagocytosis-stimulating factor(s) by morula cells in a colonial ascidian

In vitro yeast phagocytosis by haemocytes of the compound ascidian Botryllus schlosseri was studied, with particular attention to interactions among different immunocyte types. It is demonstrated that the supernatant from haemocyte cultures matched with yeast cells contains factor(s) able to enhance yeast ingestion by Botryllus phagocytes. The increase in phagocytosis is not the consequence of yeast opsonisation, as the phagocytic index does not significantly increase when yeast cells, previously incubated in the culture media, are washed and re-suspended in filtered sea water. When haemocytes were fractionated by density gradient centrifugation and each band was incubated with yeast, the ability to stimulate phagocytosis was found in the supernatants from haemocyte cultures of fractions rich in morula cells (MC). Previous studies have demonstrated that MC express molecules recognised by anti-cytokine antibodies, as a consequence of the recognition of foreign molecules or cells. Our results indicate that molecules immunoreactive with anti-cytokine antibodies are required for modulating phagocyte activity, as the above-reported enhancing effect is completely absent in the presence of anti-IL-1-α and anti-TNF-α, but not of anti-rabbit-IgG antibodies, and they also highlight the presence of ‘cross-talk‘ between MC and phagocytes. A new scenario is therefore sketched, in which MC actively recognise non-self molecular patterns and, upon this recognition, release humoural factor(s) recognised by phagocytes, which modulate phagocytosis.     

离子液体氯化1-辛基-3-甲基咪唑对酵母细胞增殖生长和细胞膜通透性的影响

为探讨咪唑类离子液体氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C₈mim][Cl])对酵母细胞的增殖生长和细胞膜通透性的影响,以不同浓度的[C₈mim][Cl]处理酵母细胞,研究离子液体对酵母细胞增殖和菌落形成的影响,通过测定酵母细胞外液蛋白质和核酸的含量,判断膜通透性的大小和[C₈mim][Cl]对细胞膜性结构的损伤。结果显示,0.1 mmol·L^-1的[C₈mim][Cl]延长了酵母细胞到达对数生长期的时间,在6～9 h之间对酵母细胞的增殖存在明显的抑制作用。1 mmol·L^-1的[C₈mim][Cl]使酵母细胞增殖不能到达对数生长期,对酵母细胞的增殖一直具有较强的抑制作用。随着离子液体浓度的增加,小菌落的数量增多。当平板内[C₈mim][Cl]浓度达到10 mmol·L^-1时,完全抑制了菌落的形成。[C₈mim][Cl]处理酵母细胞后,细胞外液中OD₂₈₀、OD₂₆₀的值显著升高。研究表明,细胞膜等膜性结构通透性的增加是离子液体[C₈mim][Cl]抑制酵母细胞增殖生长的原因之一。     

Sch9蛋白激酶调控酵母细胞全蛋白的泛素化

为探讨蛋白激酶Sch9是否影响细胞蛋白质稳态水平及其在热胁迫时的响应,以野生型、SCH9基因缺失突变体、转sch9基因ΔSch9(SCH9-3HA)酵母为材料,利用特异的泛素抗体,检测长期培养时全蛋白泛素化水平变化.结果表明,Sch9缺失引起细胞全蛋白泛素化水平降低,转sch9基因可以使细胞全蛋白泛素化水平恢复.55℃热胁迫30 min处理,突变体Δsch9全蛋白泛素化水平降低,转sch9基因Δsch9(SCH9-3HA)全蛋白泛素化水平不变,回到正常生长温度时,蛋白泛素化水平也没有改变.外加蛋白酶体抑制剂MG132时,突变体ΔSch9蛋白泛素化水平不受影响,而转sch9基因△sch9(SCH9-3HA)全蛋白泛素化水平显著增加,表明前者是自噬途径降解,而增加部分是通过蛋白酶体途径降解.蛋白激酶Sch9调控细胞全蛋白泛素化水平,以及2个不同的降解途径.