过量表达沙冬青巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI提高大肠杆菌低温与热胁迫抗性

沙冬青是我国北方内蒙古荒漠地区特有的常绿阔叶灌木,具有很强的抗低温、干旱、盐碱能力,是重要的抗逆基因资源植物.将从低温诱导的沙冬青幼苗中克隆获得的巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI亚克隆后构建到原核表达载体pTWIN1上,得到重组表达载体pT-PI,双酶切及测序结果证明pT-PI已经构建成功.将pT-PI转入大肠杆菌ER2566中,经异丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE电泳检测发现有Mr35×103的目的融合蛋白表达,与预测结果一致,其中以在37℃诱导3～4h条件下表达量最高,表明目的基因AmPI在大肠杆菌中得到了成功表达.分别测定了低温(0℃)和热胁迫(50℃)条件下AmPI宿主菌的生存能力,结果表明AmPI的表达能提高宿主菌的存活率,可能是AmPI对细胞具有保护功能.     

非纯培养物细菌蛋白酶DNA片段的克隆与表达

为了构建更多的蛋白酶基因工程菌,以及进行蛋白酶基因的直接进化研究,从非纯培养细菌总DNA中扩增各种编码蛋白酶的DNA片段.根据MEROPS和GenBank数据库中的枯草杆菌类蛋白酶的编码区和成熟肽编码序列设计并合成了10条引物.富集培养胞外蛋白酶产生菌并提取了12个总DNA样品,分别用每对引物在降落PCR (TouchdownPCR, TD-PCR)条件下进行蛋白酶编码序列的扩增.选择了19个长800 ~1 200 bp的扩增片段测序,其结果为: 8个是蛋白酶DNA片段,它们应属于4种不同的蛋白酶基因序列;同一对引物扩增到的基因序列差异性可达到32%,说明只使用基于已知序列的PCR方法从混合菌中获得新蛋白酶基因是可行的.将克隆到的1个与碱性蛋白酶E (GenBank No.AJ539133)的编码区99%相似的蛋白酶DNA片段插入pTWIN1载体,在大肠杆菌ER2566中进行表达.结果表明,表达的成熟蛋白酶可分泌到培养基中,能在牛奶平板上产生水解圈,对大肠杆菌有致死作用.图5表3参14     

重组人白血病抑制因子的表达、包涵体复性、纯化及其活性

白血病抑制因子(LIF)是一种在生物体内具有独特活性和重要调节作用因而广泛应用的多功能细胞因子.利用基因工程技术表达重组人白血病抑制因子(Recombinant human leukemia inhibitory factor,rhLIF)并进行包涵体的复性及纯化,将rhLIF基因克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建重组hLIF基因工程菌,并研究该菌株发酵条件和纯化工艺.先将种子液进行发酵培养,诱导表达,收集诱导后的细胞;对细胞破碎,收集包涵体沉淀,洗涤包涵体;用6 mol/L盐酸胍变性重溶包涵体,镍离子亲和层析柱上直接复性及纯化,并用阴离子交换进一步纯化,复性率为75%,纯度达97%.结果显示基因序列与理论序列一致,SDS-PAGE分析结果表明其表达的外源蛋白质分子量与预期的目的蛋白质相对分子量大小相一致,均为35×10~3;Western blotting、MTT活性检测结果表明,此重组hLIF融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.本研究成功建立了rhLIF原核表达、复性和纯化体系,可为进一步研究LIF生物学活性及产品开发提供试验基础.     

人α-防御素HNP-2基因在大肠杆菌中的表达

通过半化学合成方法获得具有大肠杆菌密码子偏爱性的人α-防御素(Human α-defensin或human neutrophil peptide,HNP)HNP-2基因.将其克隆到pET-32a( )表达载体,构建了重组表达质粒pET-32a( )/HNP-2.分别转化大肠杆菌BL21(DE3),ER2566以及Origami B(DE3)宿主菌,经过表达条件的优化,结果在大肠杆菌Origami B(DE3)宿主菌中得到了HNP-2基因高效率可溶性的表达,融合蛋白表达量占细菌总蛋白的60%以上.为避免表达产物水解,得到更稳定的人α-防御素,尝试以环化形式和酰胺化形式表达人α-防御素.为得到环化形式的表达,采用intein作为工具,利用其可剪接extein的特点,将其N端区域和C端区域分别融合到HNP-2的C端和N端,其两端的intein片段可将其拼接成环肽.以此为基础构建了环化表达质粒,并对表达条件进行了探索.本文采用了一种新的酰胺化方法,即将intein与HNP-2融合表达,intein对目的短肽进行酰胺化修饰.图6表1参16     

木聚糖酶基因xynB在不同大肠杆菌表达系统中的表达比较

从黑曲霉(Aspergillus niger)nl-1中克隆获得木聚糖酶基因xynB.该基因全长745 bp,含有67 bp内含子,与公布的黑曲霉xynB基因有较高的同源性.将PCR扩增的木聚糖酶成熟肽基因和含有信号肽的基因分别连接到表达载体肠杆菌Top10 F’、DH10B和两种BL21宿主中获得重组菌株.通过IPTG诱导,xynB基因在重组菌株中获得特异性表达.表达产物以胞内可溶性蛋白和不溶性包涵体形式存在.诱导4 h,重组菌株pTrc-99a-xynB[BL21 condon plus(DE3)]表达量最高,胞内酶活达到299 IU/L.重组质粒pTrc-99a-xyn B(S)在不同宿主胞内和胞外均能分泌目的蛋白,诱导10 h,胞外酶活pTrc-99a-xynB(S)[BL21 condon plus(DE3)]达到347 IU/L.而pET-20b-xynB(S)在两种BL21宿主中均不表达.经SDS-PAGE分析,以pTrc-99a和pET-20b作为表达载体时,重组蛋白相对分子质量分别约为45×103和30×103.与pET-20b相比,pTrc-99a以及自身信号肽的引导更有利于重组木聚糖酶的表达.     

重组BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白CIRP多克隆抗体的制备与鉴定

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是第一种在哺乳动物细胞中被发现的冷休克蛋白,伴随着细胞冷应激过程过量表达.为进一步研究冷诱导RNA结合蛋白CIRP的生物学功能,构建重组BALB/C鼠CIRP的原核表达载体,重组BALB/C鼠CIRP蛋白经NI-NTA亲和树脂纯化后免疫獭兔制备抗CIRP多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot检测抗体效价和抗原特异性.本实验成功构建了CIRP的原核表达载体,在E coli XL-1-blue得到了高效表达,利用原核表达包涵体蛋白免疫獭兔获得了高效价的CIRP多克隆抗体,该抗体能识别肝脏和睾丸中天然的CIRP蛋白.图5参14     

盐藻LHCB3蛋白的表达纯化及抗体制备

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)主要光捕获蛋白LHCB蛋白的功能,将已获得的盐藻Lhcb3基因构建到原核表达载体pET32a-DsLhcb3,通过优化表达条件,建立了高效的重组系统.pET32a-DsLhcb3在大肠杆菌中的优化表达条件为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h.采用镍离子亲合层析纯化获得LHCB3蛋白,并以此为抗原制备了多克隆抗体,经琼脂糖扩散检测效价,在1:16处有明显沉淀.提取盐藻总蛋白,经过制备的LHCB3抗体杂交,在29 000处获得两条明显的杂交条带,为进一步研究盐藻LHCⅡ蛋白表达机理奠定了基础.     

深黄被孢霉苹果酸酶基因的克隆和表达

为了克隆与表达深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22苹果酸酶基因,根据深黄被孢霉M6-22转录组测序结果,以其c DNA为模板PCR扩增苹果酸酶基因编码序列,经测序验证分析后将扩增片段连接到表达载体pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET32a MIME2并进一步转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,经镍柱亲和纯化目的蛋白和酶活分析确定其为苹果酸酶.PCR扩增得到全长为1 815 bp的cDNA序列,序列分析表明该序列具有一个编码604个氨基酸的开放阅读框,预测编码蛋白分子量(Mr)为66.4×10~3.预测的氨基酸序列与已报道的苹果酸酶同样具有保守的2个二核苷酸结合结构域和1个二价金属离子结合结构域,因此是一个新的苹果酸酶基因序列,命名为MIME2,Gen Bank序列号为KU097323.将该序列转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测到1条约67×10~3的蛋白条带表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱氢生成丙酮酸,同时生成NADPH,具有苹果酸酶的特性,其酶活大小为177.46 U/mg.以上结果证明所克隆的cDNA序列MIME2为1个新的苹果酸酶基因,基因编码蛋白具有苹果酸酶活性,可为深入研究苹果酸酶的结构和功能关系以及进一步应用奠定基础.     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究

根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因设计了上下游引物P1和P2,通过对铜绿假单胞菌菌株X3绿色荧光蛋白标记研究,构建了铜绿假单胞菌标记系统,获得带有EGFP标记的基因工程菌X9,为进行相关的跟踪研究创造了条件.该菌株绿色荧光标记性能稳定.通过转化子基因组DNAPCR和斑点杂交检测,外源EGFP基因存在于转化子染色体上. 图 6参 14     

邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物，以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板，扩增出邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O)基因，将该基因和表达载体pET—30a( )连接，转化E.coli JM109(DE3)，获得了高效表达的转化子，SDS—PAGE结果表明，转化子的C23O蛋白不仅在细胞内存在，而且能被分泌到胞外，薄层扫描显示，转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的42％，酶活分析表明，分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C23O比活力，Southern杂交将菌株ZL5的C23O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上。图5表1参12。     

D.radiodurans kat A和kat B基因的结构分析与功能鉴定

以简并引物PCR获得的Cat酶基因片段探针，结合生物信息学方法，探明了耐辐射奇球菌（D.radiodu-rans)基因组中存在两个编码过氧化氢酶（Catalase,Cat)的基因：katA和B.katA和katB基因长2277bp和1611bp，各编码758和536个氨基酸，用pKK223-3表达载体连接katB基因，转入Cat酶缺陷型大肠杆菌（E. coliUM2)进行表达.katB基因表达产物具有Cat酶活性，电泳迁移位置与D.radiodurans CatB酶位置相符，并可重建E.coliUM2对低浓度H2O2损伤的耐受力。     

矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BSMTcDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBSMT1(GenBank No.AA0501)和phBSMT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在Gen-Bank登录号为DQ494491,命名为phBSMT3.构建的BSMT3 cDNA的原核表达质粒pGBSMT转化BL21(DE3)E.coli,获得的重组菌株经0.01mol/LIPTG诱导后得到正确表达的GST-BSMT融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BSMT在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24     

豆豉纤溶酶在枯草杆菌WB800中的高水平表达

一个来源于豆豉产生菌DC12的新的纤溶酶基因序列被克隆测序.为了实现在枯草杆菌中高水平表达豆豉纤溶酶,将来源于枯草杆菌168的重叠启动子P43序列以及转录终止信号序列通过重叠延伸融合,将融合序列克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3中,构建了pBEP43载体.将豆豉纤溶酶基因插入到载体pBEP43后转化枯草杆菌WB800.结果表明,在P43启动子驱动下,豆豉纤溶酶基因在重组菌中的对数生长期和平衡期均获得了表达且分泌到培养基中.重组菌经培养后上清液中的纤溶酶活性最高达1270U/mL,是豆豉纤溶酶基因在自身启动子驱动下表达量的1.87倍和野生菌株枯草杆菌DC12表达量的4.1倍.图5参16     

豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.图3表1参20     

产1,3-丙二醇新型基因工程菌的构建

以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中,往往由于还原力NADH的不足,限制了1,3-丙二醇的合成,引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积,进而抑制甘油脱水酶的活性,阻碍菌体的生长,严重影响1,3-丙二醇的合成途径.为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾,本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因,构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT,成功共转入E.coli JM109,得到可利用两种辅酶(NADH、NADPH)将片油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,发酵结果表明,1,3-丙二醇产量提高了28.6%.图6表1参17     

荧光假单胞菌高效广谱载体的构建及分析

为促进高GC含量基因在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达效果更加理想、操作更加简便,本研究首先采用不依赖基因序列和连接反应的克隆(Sequence and ligation independent cloning,SLIC)方法将载体pCIBhis上与复制相关的序列和标记基因片段构建成克隆载体pCIBS1.然后优化荧光假单胞菌转化方法,用电转化法将pCIBS1导入荧光假单胞菌BL915中,随后又将T7和tac基因启动子分别插入pCIBS1中,成功构建了表达载体pCIBS3和pCIBS2.研究发现载体pCIBS1在大肠杆菌和荧光假单胞菌中均较为稳定,并且将绿色荧光蛋白基因插入表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,验证了表达载体功能.本研究构建的表达载体和建立的荧光假单胞菌BL915电转化方法,为高GC含量基因在荧光假单胞菌中的表达奠定了基础.     

嗜热脂肪土芽孢杆菌木聚糖酶基因的合成及其在大肠杆菌中的表达

来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的木聚糖内切酶XT6在工业上有着重要的应用,已经成功应用于工业规模的生产试验.本文作者在合成XT6基因全序列的同时对其密码子进行了优化,且构建重组质粒在大肠杆菌中高表达.通过优化表达条件,功能正常的XT6基因在大肠杆菌中成功过量表达,蛋白表达量占细胞中总蛋白的65%.重组表达的木聚糖内切酶XT6特性和天然酶相似,以桦木木聚糖为底物测定细胞提取物中木聚糖酶活性,最大活性高达3 030 U/mL.本文首次报道了来自嗜热脂肪土芽孢杆菌中木聚糖酶基因全序列的合成和在大肠杆菌中成功过量表达.图6表1参19